°C培养48h;挑取4-6 个单菌落，用引物对SPE2-A和SPE2-D进行PCR验证得SPE2敲除菌株BY4741-spe2。
[0034] 3、摇瓶发酵生产SAM。方法如下：挑BY4741-spe2单菌落到50mL YPD培养基， 200rpm，30°C下培养24h;然后转接到50mL产SAM培养基，每瓶接种3mL，同样条件下培养 24h;每瓶加入L-蛋氨酸粉末0. lg，摇匀，继续培养24h，离心，收集菌体，测量菌体干重并萃 取SAM，测量其浓度。其中产SAM培养基组分包括:30g/L葡萄糖、5 g//L酵母粉、5g/L (NH4) 2S〇4，、5g/L K2HP〇4，、l〇g/L KH2P〇4、〇.lg/L MnS〇4.7H2〇、0.1g/L ZnS〇4.7H2〇、0.2g/L MgCl2、〇.lg/L CaCl2和〇.lg/L C6H5Na3〇7 · 2H2O。
[0035] 4、BY4741与BY4741-spe2生产SAM能力的比较。如下表格
由上表可见，SPE2基因突变菌株比其出发菌株BY4741的SAM生产能力有提高，进一步说 明了本发明公布的提高腺苷蛋氨酸的方法行之有效。
[0036]实施例三，以双倍体酿酒酵母菌株HD为例，构建GLC3和SPE2都敲除的菌株，并比较 SAM产量。
[0037] 1、跟实例一步骤相似，先敲除GLC3基因：以pUG6为模版PCR构建GLC3敲除框，经过 LiAC转化、G418平板筛选和PCR验证得到GLC3敲除杂合子，然后将杂合子进行产孢培养，分 离孢子，进过G418平板筛选得到GLC3敲除的纯合子，并进行PCR验证确认。
[0038] 2、回收标记基因。方法如下:将GLC3敲除的纯合子单菌落置于20mL YH)摇瓶中，转 速200rpm，30°C过夜培养，然后转接2mL倒50mL YPD摇瓶中继续培养3-4个小时，0D600大约 为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清;再用0.1 M LiAC洗涤一 次，离心，去掉上清；用lmL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重悬菌体;分装为每管50 yL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞;按顺序加入 240yL PEG、36yL 1 M LiAC、50yL ssDNA和 34yL pSH65质粒，然后混匀，放置室温 15min，再 进行42°C热激20min;离心，去上清，再加入lmL YH)培养基，30°C预培养2h;离心，去上清，加 入2mL无菌水重悬，取50-100yL涂布到50yg/mL博来霉素抗性YPD平板上，30°C培养36-48h。上述博来霉素平板中挑单菌落置于20mL YPG摇瓶中，转速200rpm，30°C过夜培养，然后 取1微升加水稀释后涂布到YPD平板上，30°C培养36h;待菌落长出后，每一菌落分别接种到 YH)和G418 Yro上（注意接种到标记好的对应位置），30°C培养36h;在YPD上生长，而在G418 上生长受抑制的菌落挑出来，进行PCR验证。
[0039] 3、质粒pSH65的去除。方法如下：将验证去除好标记的菌落接种到20mL YPD摇瓶 中，200rpm，30°C培养24h;取100微升转接到20mL YH)中继续培养24h;重复上如转接和培养 两次后，取1微升菌液加无菌水稀释到100微升后涂布到Yro平板上，30°C培养36h;挑取同一 菌落分别接种到Yro和博来霉素抗性YPD(注意接种到标记好的对应位置），30°C培养36h;在 Yro上生长，而博来霉素上生长受抑制的菌落即可认为质粒PSH65去除成功。
[0040] 4、继续敲除SPE2基因，构建HD-GS。继续利用实例1的策略敲除SPE2基因，并利用本 实例步骤2和3相同策略回收敲除SPE2时所引进的标记基因，成功得到GLC3和SPE2都敲除的 无抗性标记的 HD-GS 菌株，最后用引物GLC3-A、GLC3-B、GLC3-C、GLC3-D 以及 SPE2-A、SPE2-B、 SPE2-C、SPE2-D对HD-GS进行PCR最终验证，如附图1。
[00411 5、HD-GS发酵罐培养生产SAM。与本发明实例1中步骤5相似，按照5%接种量将HD-GS 种子液接种到发酵罐中；整个过程中温度控制在30°C，用氨水调节pH为5，调节搅拌速率控 制溶氧在20%以上;整个过程中每隔俩小时取样测定一次，记录溶氧、pH、搅拌速率、0D600、 葡萄糖浓度等，反应阶段分别保存菌液离心后的上清和菌体，用于测定乙醇浓度、细胞干重 以及SAM产量等;约培养8-10个小时后，葡萄糖耗尽，开始流加葡萄糖和酵母粉混合液，如附 图3所示，每个小时调节一次流加速率;继续培养24个小时后，0D6QQ趋于稳定，开始添加蛋氨 酸和葡萄糖混合液;反应20个小时后，发酵结束。将所得数据整理，如附图3。
[0042]最终，在500 L的发酵罐上进行了腺苷蛋氨酸的中试生产，HD-GS生产SAM的量也能 达到10.71g/L，比原始菌株HD提高了 55.1%，为工业化发酵生产腺苷蛋氨酸奠定了基础。
[0U43J 买施例四：以早借体悮式菌株BY4741为例，构建GLC3和SPE2郡敵除的菌株，开比较 SAM产量。
[0044] 1、跟实例二步骤相似，先敲除GLC3基因：以pUG6为模版PCR构建GLC3敲除框，经过 LiAC转化、G418平板筛选和PCR验证得到GLC3敲除菌株。
[0045] 2、回收标记基因。方法如下：将GLC3敲除菌株单菌落置于20mL YPD摇瓶中，转速 200rpm，30°C过夜培养，然后转接2mL倒50mL YPD摇瓶中继续培养3-4个小时，0D6QQ大约为1 的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次，离心，去掉上清;再用0.1 M LiAC洗涤一次， 离心，去掉上清；用lmL 0.1M LiAC重悬菌体，转移到2mL离心管，再加入0.5mL 0.1M LiAC重 悬菌体;分装为每管50 yL，取两管，分别离心去上清，得到感受态细胞；按顺序加入240yL PEG、36yL 1 M LiAC、50yL ssDNA和 34yL pSH65质粒，然后混匀，放置室温30min，再进行42 °C热激90min;离心，去上清，再加入lmL YH)培养基，30°C预培养4h;离心，去上清，加入2mL 无菌水重悬，取50-100yL涂布到50yg/mL博来霉素抗性YH)平板上，30°C培养36-48h。上述 博来霉素平板中挑单菌落置于20mL YPG摇瓶中，转速200rpm，30°C过夜培养，然后取1微升 加水稀释后涂布到YPD平板上，30°C培养36h;待菌落长出后，每一菌落分别接种到YPD和 G418 YH)上(注意接种到标记好的对应位置），30°C培养36h;在YH)上生长，而在G418上生长 受抑制的菌落挑出来，进行PCR验证。
[0046] 3、质粒pSH65的去除。方法如下：将验证去除好标记的菌落接种到20mL YPD摇瓶 中，200rpm，30°C培养24h;取100微升转接到20mL YH)中继续培养24h;重复上如转接和培养 两次后，取1微升菌液加无菌水稀释到100微升后涂布到Yro平板上，30°C培养36h;挑取同一 菌落分别接种到Yro和博来霉素抗性YPD(注意接种到标记好的对应位置），30°C培养36h;在 Yro上生长，而博来霉素上生长受抑制的菌落即可认为质粒PSH65去除成功。
[0047] 4、继续敲除SPE2基因，构建BY4741-GS。继续利用实例二的策略敲除SPE2基因，并 利用本实例步骤2和3相同策略回收敲除SPE2时所引进的标记基因，成功得到GLC3和SPE2都 敲除的无抗性标记的BY4741-GS菌株，最后用引物GLC3-A、GLC3-B、GLC3-C、GLC3-D&& SPE2-A、SPE2-B、SPE2-C、SPE2-