司，货号：608082)和0.扣L 的内标（DM Size Sl:andard Kit -400 Base F*airs，AB sciex公司，货号:608098),再将化L的PCR产物加入其中，滴入一滴矿物质油，防止电泳过程 中由于高溫导致PCR产物挥发。
[0041 ]在另一个96孔缓冲液板的每个孔中加入约25化L的Genome Lab分离缓冲液。
[0042] 根据毛细管电泳分析仪的操作手册，将样品板和缓冲液板放入机器，运行化ag-3 分离程序。执行默认的分析方法，最后保存数据。
[0043] 针对各个基因的PCR产物片段大小不同，得到的毛细管电泳峰图，其中横坐标表示 片段长度，纵坐标表示巧光强度。
[0044] 4.结果分析 毛细管电泳分析仪自动进行数据分析。
[004引 Ξ、试剂盒的检测结果判定 1.试剂盒有效性判定 同时满足下列条件，才可进行结果判定： 1)阴性对照:在138nt~32化t之间未检测到巧光信号。
[0046] 2)阳性对照：在各扩增片段长度处各检测到一个巧光信号，且巧光信号值高于 2000。
[0047] 2.样本有效性判定： 1) 在138nt~32化t之间： 2) 若检测样本的巧光信号值至少有一个高于200000,则样本加入过量，建议对PCR产 物进行适当稀释后再进行毛细管电泳检测。
[0048] 3)若检测样本的巧光信号值均低于2000,则样本加入量较低，可适当增加 PCR产 物加入量或增加 PCR反应循环数;若仍然不符合要求，需重新制备样本。
[0049] 3.结果判定标准 1)困株鉴定 16S rRNA和ureC基因的目的片段区域出现了相应的峰且巧光信号值均高于2000,并且 16S rRNA和ureC基因对应的特异性峰面积/6-globin对应的特异性峰面积的比值大于ο. 1， 可W判断感染了幽口螺杆菌。
[0050] 2)毒力鉴定 cagA、vacA-s 1、vacA-s2、vacA-ml、vacA_m2、i ceAl、i ceA2、dupA、0 ipA、luxS基因的目的 片段区域出现了相应的峰，巧光信号值均高于2000,并且各毒力基因对应的特异性峰面积/ β-globin对应的特异性峰面积的比值大于0.1，说明患者感染的幽口螺杆菌中含有该毒力 基因表达。
[0051] 3)耐药鉴定 (1)克拉霉素耐药性 当180nt处出现峰面积/175nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明23S rRNA基因 2143位点为纯合野生型，当23S rRNA基因2143位点为纯合野生型，对克拉霉素无耐药性。当 180nt处出现峰面积/175nt处出现峰面积的比值为0.25~0.7时，定为弱阳性，当23S rRNA 基因2143位点为弱阳性时，对克拉霉素有少量耐药性。当180nt处出现峰面积/175nt处出现 峰面积的比值为0.7~4时，说明23S rRNA基因2143位点为杂合突变型，当18化t处出现峰面 积/175nt处出现峰面积的比值大于4时，说明23S rRNA基因2143位点为纯合突变型，当23S rRNA基因2143位点为纯合突变型或杂合突变型，对克拉霉素有耐药性。
[0052] (2)甲硝挫耐药性 当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明rdxA基因148 位点为纯合野生型，当rdxA基因148位点为纯合野生型，对甲硝挫无耐药性。当257.6nt处出 现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比值为0.25~0.7时，定为弱阳性，当rdxA基因148位点 为弱阳性时，对甲硝挫有少量耐药性。当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比 值为0.7~4时，说明rdxA基因148位点为杂合突变型，当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处 出现峰面积的比值大于4时，说明rdxA基因148位点为纯合突变型，当rdxA基因148位点为纯 合突变型或杂合突变型，对克拉霉素有耐药性。
[0053] (3)阿莫西林耐药性 当158.化t处出现峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明pbplA基因 1777位点为纯合野生型，当pbplA基因1777位点为纯合野生型，对阿莫西林无耐药性。当 158.9nt处出现峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值为0.25~0.7时，定为弱阳性。当pbplA 基因1777位点为弱阳性时，对阿莫西林有少量耐药性。当158.化t处出现峰面积/153.8nt处 出现峰面积的比值为0.7~4时，说明pbplA基因1777位点为杂合突变型，当158.化t处出现 峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值大于4时，说明pbplA基因1777位点为纯合突变型，当 pbplA基因1777位点为纯合突变型或杂合突变型，对阿莫西林有耐药性。
[0054] (4)左氧氣沙星耐药性 当311]11:处出现峰面积/306]11:处出现峰面积的比值小于0.25时，说明旨7'4基因261位点 为纯合野生型，当gyrA基因261位点为纯合野生型，对左氧氣沙星无耐药性。311nt处出现峰 面积/306nt处出现峰面积的比值为0.25~0.7时，定为弱阳性。当gyrA基因261位点为弱阳 性时，对左氧氣沙星有少量耐药性。311nt处出现峰面积/306nt处出现峰面积的比值为0.7 ~4时，说明gyrA基因261位点为杂合突变型，31 Int处出现峰面积/306nt处出现峰面积的比 值大于4时，说明gyrA基因261位点为纯合突变型，当gyrA基因261位点为纯合突变型或杂合 突变型，对左氧氣沙星有耐药性。
[00巧]4)定量分析 当ureC对应的特异性片段（138nt)处出现的峰面积/6-globin对应的特异性片段 (19化t)处出现峰面积的比值大于0.1，说明患者感染了幽口螺杆菌，比值与幽口螺杆菌的 拷贝数成正比，比值越大，说明幽口螺杆菌感染越严重。当ureC对应的特异性片段（138nt) 处出现的峰面积/6-gl〇bin对应的特异性片段（199nt)处出现峰面积的比值小于0.02,判为 感染阴性。当ureC对应的特异性片段(138nt)处出现的峰面积/6-globin对应的特异性片段 (19化t)处出现峰面积的比值为0.02~0.1时，需重新实验。
[0056] 4.结果判断实例 采用本实施例的试剂盒对阳性对照进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图 1戶/f示。16S rRNA、ureC、fi-globin、cagA、vacA-sl、vacA_ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、dupA、 oipA、luxS、vacA-s2、23S rRNA、rdxA、pbplA和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的 峰。该结果非常直观，1个菌种鉴定基因、2个定量基因、10个毒力相关基因、4个耐药性基因 均扩增良好。说明各引物之间没有干扰，能同时有效扩增所有目的基因。
[0057] 采用本实施例的试剂盒对阴性对照进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱 如图2所示，没有出现任何目的基因峰，只在小于l(K)nt处有非特异性背景巧光信号。
[0058] 采用本实施例的试剂盒对样本1进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如 图 3所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-ml、iceAl、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、 pbplA和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者感染 了幽口螺杆菌，且表达相应毒力因子，对克拉霉素、左氧氣沙星有耐药性，对甲硝挫、阿莫西 林没有耐药性。检测结果非常直观。
[0059] 采用本实施例的试剂盒对样本2进行PCR反应后利用采用毛细管电泳分析后的图 谱如图4所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-m2、iceA2、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、 pbplA和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者感染 了幽口螺杆菌，且表达相应毒力因子，对克拉霉素、甲硝挫有耐药性，对阿莫西林、左氧氣沙 星没有耐药性。检测结果非常直观。
[0060] 采用本实施例的试剂盒对样本3进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如 图 5所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-m2、oipA、luxS、23S 诚熱^扣4、96。1八和 gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者感染了幽口 螺杆菌，且表达相应毒力因子，对阿莫西林有耐药性，对克拉霉素、甲硝挫、左氧氣沙星没有 耐药性。检测结果非常直观。
[0061] 采用本实施例的试剂盒对样本4进行PCR反应后利用采用毛细管电泳分析后的图 谱如图6所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-ml、iceA2、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、 pbplA和gyrA基因的目标片段区域均没有出现相应的峰，但β-globin基因的目标片段区域 出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者没有感染幽口螺杆菌。检测结果非常直 观。
[0062] 实施例2 本实施例的幽口螺杆菌检测试剂盒与实施例1的其余部分相同，不同之处在于：引物混 合物仅包括针对16S rRNA基因的正向引物、针对16S rRNA基因的反向引物、针对23S rRNA 基因的正向引物、对应23S rRNA基因2143位点为碱基A的反向引物、对应23S rRNA基因2143 位点为碱基G的反向引物、针对rdxA基因的正向引物、对应rdxA基因148位点为碱基C的反向 引物、对应rdxA基因148位