30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或介于 10% 与 100% 之间的任何百分比。应 理解，治疗未必是指感染或疾病或者感染或疾病的症状的治愈或完全消除。
[0054] 如本文中所使用，术语预防感染是指在受试者开始显示一种或多种感染症状之前 或大约同时进行的能抑制或延迟一种或多种感染症状发作或加重或延迟复发的动作，例如 施用治疗剂(例如本文中所公开的组合物）。如本文中所使用，提到降低、减少或抑制包括与 对照水平相比改变10 %、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80 %、90 %或更大程度。举例来 说，如果暴露于感染的受试者中的感染或感染症状的发作、加重或复发当与暴露于感染且 未接受用于减轻感染的组合物的对照受试者相比时减少约10%，则所公开的方法被视为预 防。因此，感染发作、加重或复发的减少可W是与对照受试者相比减少约10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或介于其之间的任何量。举例来说且不具限制性， 如果与未接受预防性治疗的受试者相比群体中〉约10%的受试者未被感染，则运被视为预 防。
[0055] 还提供了一种产生本文中所公开的甲型流感病毒的方法，其包括(a)用一个或多 个包含W下各项的载体转染宿主细胞群体：（i)编码甲型流感病毒的内部基因组节段的核 酸序列；和（ii)编码在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PBl聚合酶的核酸；（b)培 养所述宿主细胞;和C)回收经修饰的甲型流感病毒。对于产生流感病毒的方法对于本领域 技术人员是已知的。在本文中所描述的产生方法中，将并入流感主病毒株的内部基因（即， PB1、PB2、PA、NP、N13、M1、BM2、NS1和NS2)的质粒与血凝素和神经氨酸酶节段的组合转染至 合适的宿主细胞中。参见例如美国专利号8，354,114,该专利W引用的方式并入本文中。任 选地，血凝素和神经氨酸酶节段可W来自于预计会造成显著局部或全面流感感染的病毒 株。典型地，基于与疫苗施用有关的合乎需要的性质来选择主病毒株。举例来说，对于疫苗 产生来说，例如对于活减毒疫苗的产生来说，可W选择主供体病毒株W实现减毒表型、冷适 应和/或溫度敏感性。举例来说，甲型流感病毒株ca A/Ann Arbor/6/60可W是主供体病毒 (参见例如化an等，Virology 380:304-311(2008))。继重排病毒在适于有效回收的溫度下， 例如在等于或低于约35°C，诸如约32°C至35°C、约32°C至约34°C或约32°C至约33°C的溫度 下在细胞培养物中复制之后，回收重排病毒。任选地，所回收的病毒可W使用诸如甲醒或β-丙内醋之类的变性剂进行灭活。任选地，在本文中所提供的生产方法中，病毒可W在鸡蛋中 进一步扩增。
[0056] 还提供了一种用于产生流感疫苗的方法，其包括：（a)用本文中所描述的任何病毒 感染细胞群体；（b)培养所述细胞；（C)从步骤(b)的培养物中收集所述病毒;和(d)用所收集 的病毒制备疫苗。
[0057] 一旦从细胞培养物中收集所述病毒后，可W根据已知的方法将所述病毒配制为免 疫原性组合物并且作为组合物施用W便在动物(例如哺乳动物）中诱导免疫反应。任选地， 所述免疫原性组合物可W配制为灭活疫苗。用于确定运些灭活疫苗是否维持与临床分离株 或来源于其的高生长株类似的抗原性的方法在本领域中是众所周知的。如W上所阐述，可 W经由常规用于或推荐用于免疫原性组合物的所有途径来施用免疫原性组合物。免疫原性 组合物可W配制为可注射或可喷射液体或已经进行了冻干或雾化干燥或风干等的制剂。免 疫原性组合物还可W经配制W便经由注射器或借助于用于肌肉内、皮下或皮内注射的无针 注射器进行施用。免疫原性组合物还可W借助于能够向粘膜递送干粉或液体或雾化喷雾的 雾化器进行施用。
[0058] 完全免疫原性组合物可W通过超滤作用进行浓缩，然后通过区带离屯、法或通过色 谱法加 W纯化。任选地，其可在纯化前后使用例如福尔马林或β-丙内醋灭活。
[0059] 公开了可用于、可联合用于、可用于制备或作为所公开的方法和组合物的产物的 物质、组合物和组分。本文中公开了运些和其他物质，并且应理解，当公开运些物质的组合、 子集、相互作用、群组等时，尽管关于运些化合物的每种不同的个别和全体组合和排列可能 并未明确公开，但本文中明确涵盖和描述了每一者。举例来说，如果公开并讨论了一种方法 并且讨论了可对该方法中包括的多种分子进行的多种修改，则除非明确相反指出，否则将 明确涵盖所述方法的各个和每个组合和排列W及可能的修改。同样，还明确涵盖并公开了 运些的任何子集或组合。运一概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的 组合物的方法中的步骤。因此，如果可W进行多个附加步骤，则应理解，运些附加步骤中的 每一个可W与所公开的方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合一起进行，并且明确涵 盖且应被视为公开了每个运种组合或组合的子集。
[0060] 本文中所引用的出版物和其所引用的材料是W全文引用的方式明确并入在此。 实施例
[0061] 推荐目前的活减毒流感疫苗(LAIV)作为主要接种策略用于年龄为2至49岁的健康 受试者，因为其与传统灭活流感疫苗相比在运个年龄组中具有更大的效力并且容易使用。 然而，不推荐目前的LAIV用于孕妇、2岁W下的儿童、免疫系统受损的人±(例如患有HIV/ AIDS的人±)或处在流感并发症的高风险之下的人±。
[0062] 目前的LAIV疫苗起初是通过冷适应获得，并且后续的工作确定减毒基因节段对应 于病毒聚合酶(PB1、PB2、PA)和核蛋白（NP)。将减毒PB2节段引入季节性流感病毒背景的基 因背景中引起溫度敏感性和减毒作用，运可W通过在高溫下对病毒进行连续传代加 W克 服。
[0063] 分析运些表型回复突变病毒，目标在于理解LAIV的减毒作用的潜在分子机制。用 于离析和表征突变病毒，包括表征溫度敏感性的方法描述于Treanor等Γ屯valuation of the genetic stability of temperature-sensitive PB2 gene mutation of the influenza A/Ann Arbor/6/60 cold-adapted vaccine virus",J.Virol.68(12):7684-8 (1994))中，该文献W全文引用的方式并入在此。
[0064] 引起PB1的319位上亮氨酸至谷氨酷胺的取代的突变是使用本文中所描述的方法 来进行。突变体的聚合酶活性是使用Bussey等（"PA residues in the 2009 H1N1 pandemic influenza virus enhance avian influenza virus polymerase activity in mammalian cells" ,J. Virol .85(14) :7020-8(2011))中所描述的小基因体测定法来测定， 该文献W全文引用的方式并入在此。据发现，PB1基因中（残基319上）的突变足W逆转病毒 RNA聚合酶的由LAIV PB2基因节段赋予的溫度敏感性表型。运是出乎意料的，因为先前的研 究已经确定运些回复突变仅在PA基因中。后续研究显示，319突变还足W逆转来自于册N1和 H9N2谱系中的两个禽病毒株的RNA聚合酶的溫度敏感性，因此显示PB1 319残基在决定病毒 聚合酶的溫度敏感性方面具有广泛相关性。总之，运些研究掲示了甲型流感病毒RNA聚合酶 的溫度敏感性和减毒作用的新颖分子决定因素。
[0065] W下研究是通过如Treanor等所阐述来构建和表征突变病毒来进行。用W下方式 表征病毒的溫度敏感性：用ts单基因置换病毒W0.01的M0I感染MDCK细胞的汇合6孔板，并 且在34°C、37°C和39°C下解育72小时。每12小时收集培养物上清液的样品且用新鲜培养基 置换。通过离屯、使运些样品澄清化并且存储在-80°C下。然后通过如Bussey等所描述的 TCID-50分析来分析样品的病毒效价。此分析中所使用的病毒具有处在A/Korea/1982背景 中的冷适应溫度敏感性减毒A/Ann Arbor/6/60(Genbank标识号:AY209938.1)的PB2节段 (参见Treanor等）。
[0066] 如W上所阐述，将季节性人类甲型流感病毒株(A/Korea/82册N2)的PB2节段置换 为得自于A/AnnArbor/6/60的冷传代分离株的PB2节段。所产生的单基因置换病毒对于在高 溫下生长具有溫度敏感性(ts)。在增高的溫度下对运种病毒母液进行连续传代，W便确定 表型回复突变单基因置换病毒。对ts PB2单基因置换病毒进行蚀斑纯化，并且分析个别蚀 斑的溫度依赖性生长性质。预期经过蚀斑纯化的病毒在34°C和37°C下能生长，但在39°C下 不生长(参见图1)。令人惊讶的是，在37°C下W及在39°C下减缓生长的病毒被纯化。
[0067] 将病毒聚合酶的所有组分都从病毒RNA克隆到哺乳动物表达载体中，然后加 W分 析。令人惊讶的是，运个系统显