[0056] 图5为普通PCR鉴定鸟类性别的灵敏度。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[005引下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060] 巧黄绿素巧光染料为向31.12mg巧黄绿素（sigma公司产品，产品目录号为B2346) 和197.9mg氯化儘(sigma公司产品，产品目录号为G5468)中加入lOmL超纯水得到的染料。 [0061 ] 化is · HCl(p服.8)为上海生科生物科技有限公司产品，产品目录号为ZC12458; Bst DNA聚合酶为N邸公司产品，产品目录号为D4579;甜菜碱为sigma公司产品，产品目录号 为B3813;MgS〇4为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为TV25671;dNTP为天根生 化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为SF357898; KC1为国药集团化学试剂有限公司产 品，产品目录号为TV24673; (NH4)2S04为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为 TV17360; 0.1 % Tween20为FLUKA公司产品，产品目录号为Y245C1。
[0062] 白冠长尾锥雌鸟记载于如下文献中：刘阳.白冠长尾锥（Syrmaticus reevesi i) 雌鸟活动区及扩散行为的无线电遥测研究.[D]北京师范大学硕±毕业论文，2006年.
[0063] 白冠长尾锥雄鸟记载于如下文献中：徐基良，张晓辉，张正旺等.白冠长尾锥雄鸟 的冬季活动区与栖息地利用研究.[J]《生物多样性》，2005,13(5) :416-423.
[0064] 实施例1、鉴定鸟类性别的LAMP成套引物的制备
[0065] 从美国基因数据库检索获得鸟类性别基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析， 获得如序列表中序列7所示的与鸟类性别相关的特异性保守祀序列，根据该保守祀序列，并 经过大量预实验，设计出鉴定鸟类性别的LAMP成套引物。
[0066] 鉴定鸟类性别的LAMP成套引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和引 物B3组成，各条引物均为单链DNA分子，它们的核巧酸序列依次如序列表中的序列1、序列2、 序列3、序列4、序列5和序列6所不。
[0067] 引物序列如下：
[006引 引物FIP: 5 ' -CCGCACATTAGGTGATTCTAAAACAGGGGAAAGCTGTATACAAGC-3 ' ；
[0069] 引物BIP: 5' -TTAACTGAAATCCACTTCAGGTCAGGGACTTCAGACCATCTTCT-3' ；
[0070] 引物LF: 5 ' -GTTGTTGGCACTGATTTAGTTCCTT-3 ' ；
[0071 ]引物LB: 5 ' -TTATCTCTCAGACTCAACCTGAACC-3 ' ；
[0072] 引物F3:5 ' -TGGTTAACCTATTTCATTGACAA-3 ' ；
[0073] 引物B3:5 ' -CCTCTCAGTTCACTTTGTGTT-3 '。
[0074] 审恪引物FIP、引物BIP、引物LF、引物LB、引物F3和引物B3。
[0075] 实施例2、鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的制备和最佳溫度的筛选
[0076] 一、鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的制备
[0077] 制备鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒，包括试剂盒C或试剂盒D:
[0078] 试剂盒C为将反应试剂C、阴性对照和阳性对照组装在一起得到的产品；
[0079] 试剂盒D为将反应试剂D、阴性对照和阳性对照组装在一起得到的产品。
[0080] 每23化反应试剂C包括20mM Tris ·肥l(p册.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,0.1% Tween20,0.8M甜菜碱，8mM MgS〇4，1.4mM dNTP(每种），8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和引物 BIP各1.6μπιο1、引物LF和引物LB 0.祉mol、引物F3和引物B3各0.2μπιο1，余量为去离子水。 [0081 ]每24化反应试剂D包括20mM Tris ·肥 1(抑8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,0.1% Tween20,0.8M甜菜碱，8mM MgS〇4，1.4mM dNTP(每种），8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和引物 BIP各1.6皿ol、引物LF和引物LB 0.8μπιο1、引物F3和引物B3各0.2μπιο1、巧黄绿素巧光染料1 yL，余量为去离子水。
[0082] 所述阳性对照为从白冠长尾锥雌鸟的全血中提取的基因组DNA，基因组DNA浓度为 SOng/yL，使用时加入化L。
[0083] 所述阴性对照为灭菌超纯水，使用时加入化L。
[0084] 二、利用步骤一制备的试剂盒C确立LAMP扩增最佳溫度
[00化]1、从白冠长尾锥雌鸟的全血中提取基因组DNA，基因组DNA浓度为SOngAiL。
[0086] 2'LAMP
[0087] 具体的检测方法如下：
[008引向试管中加入23化反应试剂C和2化步骤1提取的白冠长尾锥雌鸟的基因组DNA，得 到反应液，然后将反应液于60°C反应50分钟。W反应时间为横坐标，W650皿下浊度仪测量 的浊度为纵坐标，得到浊度曲线。
[0089] 按照上述方法，将 60°C 替换为 61°(3、62°(3、63°(3、64°(3、65°(3、66°(3或67°(3，其它步骤 均不变，得到相应的浊度曲线。
[0090] 结果表明（图1)，所有的浊度曲线均呈现典型的"S型"。可见，LAMP扩增溫度可为60 °C~67°C、反应50min。LAMP扩增最佳溫度具体可为64°C、反应50min。
[0091] 实施例3、实施例2制备的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒的特异性
[0092] 样本1、样本7、样本8、样本11、样本23、样本26、样本27和样本30均为白冠长尾锥雌 鸟;样本3、样本5、样本16、样本18、样本19、样本21、样本25、样本28、样本29、样本31、样本 32、样本33和样本34均为白冠长尾锥雄鸟。
[0093] W实施例2制备的鉴定鸟类性别的LAMP试剂盒C进行特异性实验，实验重复Ξ次， 每次重复的步骤如下：
[0094] 1、从待测样本(样本1、样本7、样本8、样本11、样本23、样本26、样本27、样本30、样 本3、样本5、样本16、样本18、样本19、样本21、样本25、样本28、样本29、样本31、样本32、样本 33或样本34)的全血中提取基因组DNA，基因组DNA浓度均为SOng/yL。
[00M] 2、向试管中加入23化反应试剂C和化L步骤1提取的待测样本的基因组DNA得到反 应液，然后将反应液于64°C反应50分钟。W反应时间为横坐标，W650nm下浊度仪测量的浊 度为纵坐标，得到浊度曲线。
[0096] 结果观察和判定：如果浊度曲线呈现典型的"S型"、则待测样本为或候选为雌性； 如果浊度曲线呈现为水平直线、则待测样本为或候选为雄性。
[0097] 实验结果表明（图2 )，加入样本1的基因组DNA、样本7的基因组DNA、样本8的基因组 DNA、样本11的基因组DNA、样本23的基因组DNA、样本26的基因组DNA、样本27的基因组DNA或 样本30的基因组DNA的试管进行LAMP均得到典型的"S型"扩增曲线，可见样本1、样本7、样本 8、样本11、样本23、样本26、样本27和样本30均为或候选为雌性;而加入样本3的基因组DNA、 样本5的基因组DNA、样本16的基因组DNA、样本18的基因组DNA、样本19的基因组DNA、样本21 的基因组DNA、样本25的基因组DNA、样本28的基因组DNA、样本29的基因组DNA、样本31的基 因组DNA、样本32的基因组DNA、样本33的基因组DNA或样本34的基因组DNA的试管进行LAMP 均不能得到典型的"S型"扩增曲线，可见，样本3、样本5、样本16、样本18、样本19、样本21、样 本25、样本28、样本29、样本31、样本32、样本33和样本34均为或候选为雄性。可见，