号探针ssDNA为5 ’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTCCCATGCTCC_3 ’。所述DNA扩增体系包括缓冲溶液，缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29 DNA聚合酶。所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。
[0024]实施例2
赭曲霉毒素A的快速检测方法，具体操作过程如下:
将各DNA储备液在95°C下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0 μπιο?赭曲霉毒素A核酸适体(Apt)的杂交缓冲溶液40 μ!^Ρ3.0 μπιο?信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40 yL置于2ml离心管中，在37°C下杂交I小时，生成赭曲霉毒素A核酸适体-信号探针杂交物(Apt - ssDNA) ο
[0025]在37°C下，分别依次将浓度为O?50ng/mL的赭曲霉毒素A添加到Apt- ssDNA溶液中，赭曲霉毒素A与赭曲霉毒素A核酸适体反应，生成核酸适体-赭曲霉毒素A，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余(未反应的)Apt- ssDNA和核酸适体-赭曲霉毒素A等物质。
[0026]加入10 yL缓冲溶液(缓冲溶液组成为50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4, pH 7.5 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向体系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反应15分钟，使得以赭曲霉毒素A核酸适体-信号探针杂交序列(Ap-ssDNA)为摸板扩增成双链DNA。在65°C下保持10分钟使Phi29 DNA去活。
[0027]再向该反应体系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反应30分钟，Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不水解而保留下来。
[0028]向反应液中加入25 yL I mmol硝酸铜和180yL PBSClO mM，pH7.0)。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入10yL浓度为I mM的新制备的抗坏血酸溶液。然后在45°C下反应5?10 min。将溶液转移至微量比色皿，以波长为340 nm光为激发光，测定体系荧光发射(520 nm - 660 nm)光谱的荧光强度，依据荧光强度与赭曲霉素的量的关系，进行赭曲霉毒素A的定量测定，结果如图1所示。
[0029]线性范围0.002-0.20ng/mL，线性方程为:y = 280.07 + 94.92 lgC，相关系数r=0.9981，检测限I pg/mL，回收率在98.5?114.2%。其它真菌毒素等生物小分子赭曲霉毒素A的检测无干扰。
【主权项】
1.一种赭曲霉毒素A的快速检测方法，其特征是，该方法包括如下步骤: (A)使赭曲霉毒素A核酸适体(Apt)和可与赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针DNA( ssDNA)杂交，形成杂交链； (B)使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有赭曲霉毒素A存在时，杂交链选择性地与赭曲霉毒素A反应释放出单链信号探针ssDNA; (C)为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，选择性地将双链DNA水解成单核苷酸，留下单链信号探针ssDNA ； (D)利用赭曲霉毒素A核酸适体-赭曲霉毒素A结合体不能诱导铜离子还原生成近红外荧光的铜纳米粒子，只有单链信号探针ssDNA能够诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的赭曲霉毒素A的含量。2.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的检测方法，其特征是，所述赭曲霉毒素A核酸适体为5 ’ -GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3 ’。3.根据权利要求1或2所述的赭曲霉毒素A的检测方法，其特征是，所述的单链信号探针ssDNA为5’ _xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx TGTGTCCCATGCTCC-.3，。4.一种赭曲霉毒素A的快速检测方法，还提供检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征是，其至少包括:赭曲霉毒素A核酸适体、可与赭曲霉毒素A核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。5.根据权利要求4所述的检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征是，所述赭曲霉毒素A核酸适体为5 ’ -GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3 ’。6.根据权利要求4或5所述的检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征是，所述的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGTCCCATGCTCC-.3，。7.根据权利要求4所述的检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征是，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP和Phi29 DNA聚合酶;所述缓冲溶液由Tris-HCl'MgCl2、(NH4)2S04组成。8.根据权利要求4所述的检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征是，所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。9.根据权利要求4所述的检测赭曲霉毒素A的试剂盒，其特征是，所述的铜离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。10.—种可用于检测赭曲霉毒素A的赭曲霉毒素A核酸适体，其特征是，其碱基序列为.5，-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAC-3，。
【专利摘要】本发明涉及一种赭曲霉毒素A的快速检测方法，该方法包括如下步骤：（A）使赭曲霉毒素A核酸适体（Apt）与单链信号探针DNA（ssDNA）杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品接触，当待测样品中有赭曲霉毒素A存在时，杂交链与赭曲霉毒素A反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，而单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；（D）在ssDNA诱导下，铜离子还原生成近红外荧光铜纳米粒子；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的赭曲霉毒素A的含量。该方法具有高灵敏度，操作简单，低成本等特点。
【IPC分类】C12N15/115, C12Q1/68
【公开号】CN105543376
【申请号】CN201610043741
【发明人】曾云龙, 刘婷, 黄昊文, 徐合意, 邓克勤, 易守军, 唐春然
【申请人】湖南科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月24日