30min，然后采用超声法对其进一步裂解，超声功率为300W，超声模式 为间隔2s超声2s，累计超声时间为2min，获得林蛙油裂解液；
[0030] 向林蛙油裂解液加入200mL 10mmol/L磷酸缓冲液(pH=7)，配制成林蛙油组织悬 浊液，然后加入lmL蛋白酶抑制剂和50yL核酸酶混匀，4°C下静置过夜，10000rpm/min离心 20min，弃去沉淀，收集上清液，获得林蛙油粗蛋白提取液。
[0031] (3)林蛙油粗蛋白的沉淀
[0032] 向林蛙油粗蛋白提取液中加入硫酸铵固体，使其浓度为25%，搅拌使硫酸铵完全 溶解，4°C下静置过夜，10000rpm/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀，获得林硅油粗蛋 白。
[0033] (4)林蛙油中抗氧化蛋白的分离
[0034]在规格为1.6 X 100cm的层析柱中填充葡聚糖凝胶G-100,以纯水作为洗脱液，用恒 流栗调节其流速为l〇cm/h;将林蛙油粗蛋白用10mm〇l/L的磷酸缓冲液(pH=7)溶解后，将其 加入到层析柱后，收集柱流出物150-200mL部分的液体，得到林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。 [0035] (5)林蛙油中抗氧化蛋白溶液活性的测定
[0036] 获得的林蛙油中抗氧化蛋白溶液用邻苯三酚法测定其抗氧化活性，测得的抑制率 为47.35X 10-2。
[0037] 获得的林蛙油中抗氧化蛋白溶液经胰蛋白酶液酶解后，用高效液相色谱-质谱联 用检测。高效液相色谱条件中，流动相A为0.1 %甲酸的水溶液，B为含有0.08%甲酸的80% 的乙腈水溶液，梯度洗脱。样品经过高效液相色谱分离后，再由质谱系统将肽段打成不同分 子量的碎片；其中，碰撞能量为35.0V，碰撞方式为CID，然后经过质谱仪中Ion Trap质量分 析器检测得到质谱图。扫描模式为Top-speed，cycle time 3s，动态排除60s，扫描范围为 350.0-1800.Om/z。通过检索蛋白数据库分析质谱图，发现了三种活性蛋白，分别为Q6DDC2、 F6UKQ6和Q28E35,三种活性蛋白的氨基酸序列见表1，二级质谱图见图1-3。
[0038] 表1:三种活性蛋白（Q6DDC2、F6UKQ6、Q28E35)的氨基酸序列
[0039]
【主权项】
1. 一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为:将泡发后的 林蛙油用液氮研磨成粉，加入裂解液裂解后并进一步采用超声裂解;然后加入磷酸缓冲液、 蛋白酶抑制剂和核酸酶，浸泡后离心，收集上清液;在上清液中加入硫酸铵，充分沉淀后，离 心，收集沉淀;将沉淀用磷酸缓冲液溶解后，通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离，收集分离组 分，得到具有林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。2. 根据权利要求1所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备 方法的具体步骤如下： (1) 林蛙油干品的泡发:在林蛙油干品中加入纯净水，于2-6 °C下泡发8-16h，获得泡发 后的林蛙油； (2) 林蛙油中粗蛋白的提取:泡发后的林蛙油在液氮中研磨至粉末，加入裂解液和蛋白 酶抑制剂，在冰上孵育20_40min，然后采用超声法对其进一步裂解，获得林蛙油裂解液；向 林蛙油裂解液中加入磷酸缓冲液、蛋白酶抑制剂和核酸酶，在温度为2-6 °C下，浸泡8-16h 后，离心收集上清，获得林蛙油粗蛋白提取液； (3) 林蛙油粗蛋白的沉淀：向林蛙油粗蛋白提取液中加入硫酸铵固体，使硫酸铵的终浓 度为20-30%，并搅拌使酸铵固体完全溶解后，于2-6°C下静置8-16h，离心收集沉淀，获得林 蛙油粗蛋白； (4) 林蛙油中抗氧化蛋白的分离:将林蛙油粗蛋白用磷酸缓冲液溶解后，采用葡聚糖凝 胶G-100柱层析分离，收集柱流出物为150-200mL部分的液体，得到林蛙油中的抗氧化蛋白 溶液。3. 根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中所述超声法裂解的条件为:超声功率为250-350W，超声模式为间隔2-3s超声2-3s，累计超 声时间为2_3min。4. 根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述磷酸 缓冲液的浓度为10-100mm〇l/L，pH为7。5. 根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2) 与步骤(3)中所述离心的转速为8000-12000rpm/min，离心15_25min。6. 根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述葡聚 糖凝胶G-100柱层析分离的条件为:层析柱的规格为1.6X 100cm，洗脱液为纯水，洗脱液流 速为 8-12cm/h。7. 权利要求1-6任一项所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法所制备的抗氧化蛋 白溶液，其特征在于，所述的抗氧化蛋白溶液用邻苯三酚法测定，抑制率大于45 X 10-2。8. 权利要求1-6任一项所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法所制备的抗氧化蛋 白溶液，其特征在于，所述的抗氧化蛋白溶液用胰蛋白酶解后获得了三种抗氧化活性蛋白， 分别为 Q6DDC2、F6UKQ6 和 Q28E35。
【专利摘要】本发明公开了属于生物技术领域的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法。所述制备方法的步骤为：林蛙油干品的泡发，林蛙油中粗蛋白的提取，林蛙油粗蛋白的沉淀和林蛙油中抗氧化蛋白的分离。所述的制备方法简单、高效、安全而且重复性好；用该方法获得的抗氧化蛋白溶液，具有安全、高效、活性高的特点，用邻苯三酚法测定的其抑制率在45×10-2以上，用胰蛋白酶对其进一步酶解后获得了三种抗氧化活性蛋白，分别为Q6DDC2、F6UKQ6和Q28E35；将获得的抗氧化蛋白直接包装或经过冷冻干燥后得到林蛙油蛋白成品，可广泛用于食品、保健品和食品添加剂中。
【IPC分类】C07K14/435, C07K1/16, A61P39/06, C12P21/06
【公开号】CN105566476
【申请号】CN201511001220
【发明人】林燕, 马晓东, 李重九, 万飞飞, 傅利娟, 徐蕾
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月28日