R3〉M-7.2.42和MAK<人肥R3〉M-7.3.8。一抗溫育于RT和37 °C实施60 分钟。使用HRP缀合的抗小鼠 Fab作为二抗。如制造商推荐的那样制备DAK-H3-I讨亢体的稀释 液，并根据需要调整(检测)二抗的选择。将膜用E化(Amersham)显现，并使X射线胶片曝光。 [01巧]图1中给出各个印迹的结果。比较性Western印迹分析指示新开发的MAK<人皿R3〉 M-7.2.42和MAK<人肥R3〉M-7.3.8特异性检测肥R3且显示与肥R1，肥R2，皿R4或其它蛋白没 有交叉反应。运些结合特征可见于RT和37°C，而来自化ko的肥R3单克隆抗体DAK-册-1C于37 °C显示显著更弱的结合活性。因此，与来自化ko的现有技术单克隆抗肥R3抗体DAK-H3-IC相 tt，新开发的MAK<人肥R3〉M-7.2.42和MAK<人肥R3〉M-7.3.8在Western印迹测定法中显示卓 越的结合特征，特别是在自动化染色系统中使用的溫度条件下。
[0136] b)非小细胞肺癌(NSCLC)样品的比较性Western印迹测定法
[0137] 裂解具有0至高的不同皿R3表达水平的新鲜冷冻的NS化C样品，并于37°C用141(<人 皿R3〉M-7.2.42或来自Dako的抗体DAK-H3-IC进行分析，与实施例3a)中描述的SDS-PAGE/ Western印迹规程类似。
[0138] 图2中给出各个印迹的结果。比较性Western印迹分析指示来自化ko的现有技术单 克隆抗皿R3抗体DAK-册-1C相比，新开发的MAK<人肥R3〉M-7.2.42显示显著更高的针对肥R3 的结合灵敏度。
[0139] 实施例4:测序
[0140] 为了获得选定杂交瘤克隆的DNA序列，进行5'Race PCR。为了RT-PCR，使用总RNA纯 化试剂盒(Qiagen)自5xl06个细胞制备总RNA。使用5'prime RACE PCR试剂盒(Roche)进行 逆转录和PCR。通过凝胶电泳及随后的凝胶提取来纯化来自重和轻链的所得PCR片段。使用 Τορο Zero-Blunt克隆试剂盒（Invitrogen)克隆PCR片段，并转化入化学感受态细胞中。对 来自每个杂交瘤的数个克隆进行测序W获得选定克隆的共有序列。
[0141] 实施例5:免疫组织化学
[0142] a)使用单克隆抗体MAK<人肥R3〉M-7.2.42和MAK<人皿R3〉M-7.3.8对细胞系对照样 品的免疫组织化学
[0143] 使用FF阳细胞系对照显示新开发的肥R3单克隆抗体MAK<人皿R3〉M-7.2.42和MAK< 人皿R3〉M-7.3.8的合适性。因此，用4%PBS缓冲的甲醒固定肥R1，皿R2，皿R3或肥R4转染或 未转染HEK293细胞，并随后在石蜡中包埋。
[0144] 在Ventana Benchmark XT自动化IHC染色仪上实施所有染色规程，使用Ventana缓 冲液和试剂（即标准细胞条件化l(CCl)试剂等等)进行样品制备及ul化aView DAB作为检测 系统。
[014引根据图3显而易见的是，新开发的皿R3单克隆抗体MAK<人肥R3〉M-7.2.42和141(<人 肥R3〉M-7.3.8只对肥R3转染细胞显示特异性膜染色。肥R1，皿R2和皿R4转染细胞和对照细 胞呈阴性。皿R3单克隆抗体MAK<人肥R3〉M-7.2.42和MAK<人皿R3〉M-7.3.8对皿R3转染细胞 显示优秀的I肥染色，如果在Ventana Benchmark XT分析仪上依照标准方案使用的话(见图 3,肥R3标题下的细胞染色）。
[0146] b)FF阳巧自小细胞肺癌(NSCLC)样品的比较性免疫组织化学测定法
[0147] 进一步评估单克隆抗体MAK<人皿R3〉M-7.2.42对于福尔马林固定石蜡包埋组织 (FF阳T)样品的免疫组织化学染色的合适性，与来自化ko的单克隆现有技术抗体DAK-册-1C 比较。在常规福尔马林固定石蜡包埋NS化C组织样品上实施免疫组织化学测定法。在 Ven化na Benchmark XT平台上实施MAK<人肥R3〉M-7.2.42的染色，使用标准试剂和规程（即 标准细胞条件化l(CCl)试剂等等)进行样品制备及ultraView DAB作为检测系统。在半自动 化化ko自动染色仪平台上实施化ko的DAK-H3-IC抗体对皿R3的免疫组织化学测定法，使用 叫traVision LP检测系统和DAB。手工进行脱石蜡和抗原修复步骤的规程。来自化ko的DAK- 册-1C抗体不能在Ventana Benchmark XT系统上使用，因为它在运种平台上没有显示FF阳T 样品中的任何结合活性。
[0148] 根据图4A(它是图4B中显示的组织样品的放大部分)显而易见的是，新开发的单克 隆抗体MAK<人肥R3〉M-7.2.42显示肿瘤细胞上的强膜染色。染色强度比用化ko的针对肥R3 的DAK-H3-IC现有技术抗体获得的染色强度显著更强。因此，单克隆抗体MAK<人皿R3〉M- 7.2.42显示针对FFPET样品中肥R3的高结合特异性和灵敏度，并且在自动化系统中用于临 床人肿瘤样品的染色时提供肥R3表达的可靠检测。
[0149] C)来自肺和结肠癌的人肿瘤组织样品的比较性免疫组织化学测定法
[0150] 为了分析新抗皿R3抗体的免疫组织化学的灵敏度，与商品化抗体比较，实施连续 切片的染色。制备来自肺和结肠癌的福尔马林固定石蜡包埋人肿瘤组织的3μπι连续切片。在 Roche/Ven化na Benchmark XT仪器上实施所有染色。为了抗原修复，应用缓冲液CC1达60分 钟，继W不同一抗(MAK<人皿R3〉M-7.3.8和Santa Cruz C17)染色。使用Ventana OptiView 试剂盒进行一抗检测。W125ng/ml的浓度使用运两种抗体。
[0151] 如图5A至D所示，抗体MAK<人皿R3〉M-7.3.8能清楚地检测肿瘤组织内皿R3的表达 和膜定位，甚至当肥R3小量表达时。与新抗体7.3.8相比，商品化抗体C17对同一肿瘤案例的 染色检测不到。
【主权项】
1. 一种分离的结合人HER3的抗体或其抗原结合部分，其特征在于： 重链可变域包含 包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列的CDR1H区， 包含选自SEQ ID N0:2和SEQ ID勵:3的氨基酸序列的0?2!1区，和 包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3H区，且 轻链可变域包含 包含SEQ ID勵:5的氨基酸序列的0?11^区， 包含选自SEQ ID N0:6和SEQ ID勵:7的氨基酸序列的0?21^区，和 包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3L区。2. 依照权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其特征在于： 重链可变域包含选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，且 轻链可变域包含选自SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。3. -种分离的结合人HER3的抗体或其抗原结合部分，其特征在于： 重链可变域包含 包含自SEQ ID NO: 1通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的⑶R1H区， 包含自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸 序列的CDR2H区，和 包含自SEQ ID N0:4通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的⑶R3H区， 且 轻链可变域包含 包含自SEQ ID NO: 5通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的⑶R1L区， 包含自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 7通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸 序列的CDR2L区，和 包含自SEQ ID NO: 8通过一处或多处保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列的⑶R3L区。4. 依照权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中⑶R1L区包含自SEQ ID N0:5通过第5 位处的保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列。5. 依照权利要求4的抗体或其抗原结合部分，其中SEQ ID NO: 5第5位处的保守氨基酸 替代为苏氨酸/丝氨酸替代。6. 依照权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中⑶R3L区包含自SEQ ID N0:8通过第6 位和/或第9位处的保守氨基酸替代而修饰的氨基酸序列。7. 依照权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中SEQ ID NO:8第6位处的保守氨基酸 替代为缬氨酸/丙氨酸替代且/或其中SEQ ID N0:8第9位处的保守氨基酸替代为丙氨酸/苏 氨酸替代。8. -种分离的结合人HER3的抗体或其抗原结合部分，其特征在于： 重链可变域包含与SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 10具有至少95%序列同一性的氨基酸序 列，且 轻链可变域包含与SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少95%序列同一性的氨基酸 序列。9. 依照权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合部分，其特征在于:所述抗体是单 克隆抗体。10. -种用于实施免疫组织化学的方法，该方法包括下述步骤： a) 将组织样品与依照权利要求1至9中任一项的抗体或其抗原结合部分一起温育，由此 发生所述抗体对所述组织中的HER3的结合，并 b) 对所述组织样品针对步骤(a)中结合的抗HER3抗体进行染色。11. 依照权利要求10的方法，其中所述组织样品为经过甲醛固定和石蜡包埋的（FFPE) 组织样品。12. 依照权利要求10或11的方法，其中步骤a)和b)是使用自动化设备实施的。13. -种用于在甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)样品中检测人HER3的试剂盒，所述试剂 盒包含： 依照权利要求1至9中任一项的抗体或其抗原结合部分;和 用于检测所述抗体或其抗原结合部分的试剂。14. 一种编码结合人HER3的抗体的重和轻链的核酸，其特征在于，所述抗体包含依照权 利要求1至8中任一项的重链可变域和轻链可变域。15. -种表达载体，其特征在于:包含依照权利要求14的核酸以在原核或真核宿主细胞 中表达依照权利要求1至8中任一项的抗体。16. -种原核或真核宿主细胞，其包含依照权利要求15的表达载体。17. -种用于生成依照权利要求1至8中任一项的重组抗体的方法，其特征在于:在原核 或真核宿主细胞中表达依照权利要求14的核酸，并自所述细胞或细胞培养物上清液回收所 述抗体。
【专利摘要】本发明涉及分离的结合人HER3的抗体或其抗原结合部分。新抗体具有极大效用，因为它们容许灵敏且特异性地检测人HER3。例如，有可能在组织样品中检测人HER3，甚至在此类组织样品是福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)样品时。
【IPC分类】C07K16/32
【公开号】CN105593241
【申请号】CN201480051510
【发明人】M·索库波瓦, M·施拉姆尔, B·博森迈尔, P·C·罗奇, M·耶格, S·齐亚代克
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司, 文塔纳医疗系统公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月2日
【公告号】CA2924386A1, EP3036259A1, WO2015049355A1