Phbv共聚物的制备方法及由此制备的phbv共聚物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明总地设及一种微生物合成共聚物，更具体地，设及由一种嗜盐古菌发酵生 产的P皿V共聚物、其生产方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 聚径基脂肪酸醋（Polyhy化oxya；Lkanoates, PHA)是一类W径基脂肪酸为单体的 生物聚醋，可由多种细菌和某些嗜盐古菌在营养条件不均衡时产生。PHA在胞内W疏水性的 颗粒存在，主要作为胞内碳源、能源及还原力的胆藏性物质。PHA具有与传统的石油化工塑 料相似的材料学性质，但可由糖类等可再生的碳源合成，并且可完全降解进入自然界的生 态循环，因此被认为是一种"绿色塑料"。作为一种生物可降解塑料，PHA具有从刚性材料到 弹性体的性能，可应用于各种包装材料和日常消费用塑料制品W及纺织纤维等等。特别是 在医疗领域，PHA具有的良好的生物相容性及生物可降解性，使其在细胞组织工程领域有很 大的应用潜力。
[0003] 研究发现组成PHA的单体已超过150种，包括直链、支链、饱和、不饱和及芳香族 的各种径基脂肪酸，因此PHA的种类繁多。目前，研究最多的短链PHA包括聚径基下酸醋 (P皿）和聚径基下酸径基戊酸醋（P皿V)，且已实现了工业化生产。P皿性脆，断裂伸长率很 低，且在加热溫度高于烙点（18(rC )10°C时，就会分解，从而增加了 P皿的后处理加工的难 度，运些缺点大大限制了它的应用范围。P皿V由两种单体，3-径基下酸（3皿）和3-径基戊 酸（3HV)共聚而成。3-径基戊酸单体的渗入使P皿V的结晶结构明显改变，带来硬度下降、 强度下降、烙点下降，但分解溫度却没有下降，而且随着3HV的加入，结晶的晶体规整性下 降且呈现不同的结晶形态，运对P皿V性能都有改进作用。
[0004] 然而，与采用化工方法合成聚合物不同，利用微生物合成的PHA难W任意地调节 产物的组成、结构和各项性能。目前利用微生物合成来改进PHA性能的方法还非常有限。 阳0化]例如美国专利No. US5, 536, 419中公开了运一种利用嗜盐古菌生产聚径基烷基酸 醋时的提取产物的方法，但是未设及产物性能的改进。
[0006] 再如中国专利申请NO.CN201410093245. 3中公开了一种W葡萄糖为底物连续生 产P皿V的方法，可将种群富集和发酵生产的步骤在同一个反应器内完成。该方法在一定程 度上简化了工艺，但是对产物P皿V的性能也无改进。
[0007] 为了适应各种用途和加工的需要，主要是利用PHA与其他聚合物共混的方法来弥 补各聚合物的不足。例如中国专利申请No. CN 200810216781.2中将一种或多种PHA与其 他弹性体（如SEBS、TPV、TPE、TPU等）共混加工，W提高材料的可加工性。再如中国专利申 请No. 201310526584. 1中公开了一种中链PHA缝合线，该缝合线是将PHA与PLA(聚乳酸） 共混纺丝得到。
[0008] 由于PHA良好的生物相容性，W及共聚物所具有的一定的强度和柔初性，已有很 多关于PHA在诸如组成工程等医学领域的应用报道，如屯、脏阀n、屯、血管修补材料和移植 材料等。此外，由于该材料是利用可再生物质作为碳源，其生产也是利用微生物发酵，并且 可完全降解，不但能够缓解对不可再生的化石能源的需求，其生产过程和材料本身也是环 境友好的，因此是一类具有广阔应用前景的绿色材料。
[0009] 与主要积累P皿的细菌不同，嗜盐古菌可W积累材料性能更加优良的P皿V。此外， 嗜盐古菌作为P皿V的生产菌株还具有如下优点。首先，由于嗜盐古菌生活在高盐环境中， 可W简化灭菌甚至省略灭菌，从而降低生产成本。其次，由于嗜盐古菌胞内积累了高浓度的 钟离子，使得嗜盐古菌在水中便可裂解，使其提取工艺非常简单环保。另外，嗜盐古菌合成 的P皿V具有烙点低，分子量大，分子量分布窄等特点。但嗜盐古菌生产的P皿V中3-径基 戊酸的比例单一，因此，有必要对运类材料的各项性能进行进一步的生物改性，W便能够用 于更为广泛的应用中。
【发明内容】
[0010] 为此，本发明提供了一种通过改进发酵条件来调整和改进P皿V共聚物性能的方 法。该方法通过选择碳源的种类、用量，获得性能可控的P皿V共聚物。根据本发明的方法 所获得的P皿V共聚物具有良好的热性能和可加工性能，并且可在一定范围内进行调节，从 而得到能适于不同需求的共聚物。
[0011] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种P皿V共聚物的制备方法，所述方法包 括：
[0012] 将嗜盐古菌化Ioferax mediterranei微生物种子液接种至含有发酵培养基的发 酵罐中进行发酵的步骤；和从发酵液中提取P皿V共聚物的步骤，其中，在发酵步骤中，W戊 酸盐（醋）和糖类作为碳源。培养基中戊酸盐（醋）的浓度为5~16mM，优选5. 5~15mM， 更优选6~llmM。
[0013] 糖类的浓度为25~llOmM，优选为55~IOOmM ;通常W克每升计，为例如5~20g/ L优选为10~18邑/1，常选用约lOg/L。
[0014] 所述戊酸盐（醋）可选自由戊酸的碱金属盐、碱±金属盐和戊酸的Cl~C4烷基 醋所组成组中的至少一种。
[0015] 优选地，所述戊酸盐（醋）可选自由戊酸钟、戊酸钢、戊酸儀、戊酸巧、戊酸甲醋和 戊酸乙醋所组成组中的至少一种。
[0016] 所述糖类可为单糖、二糖或多糖，优选地为葡萄糖、薦糖、乳糖、果糖、淀粉中的一 种或多种，最优选为葡萄糖。
[0017] 根据一种实施方式，在发酵期间，可补充加入戊酸盐（醋）至少一次。优选地，戊 酸盐（醋）的初始浓度和补充加入戊酸盐（醋）的浓度可为5~lOmM、优选6~9mM。各 次加入的碳源浓度可W相同，也可W不同。
[0018] 根据本发明的实施方式，所述发酵步骤中，通气量为2~1: Ivvm,优选为1. 5~ 1. 2: IvvITId
[0019] 根据本发明的实施方式，所述发酵可持续16~48小时，优选24~48小时D
[0020] 根据本发明的实施方式，所述发酵步骤中，控制发酵液的抑值保持在中性或接近 中性的条件下，例如6. 5~7. 5,优选地为6. 8~7. 2,最优选为6. 9~7. 1。 W21] 根据优选的实施方式，所述嗜盐古菌化Ioferax mediterranei微生物为 比mediterranei CGMCC 1. 2087,或者为多糖合成功能缺失的H.mediterraneiESl。优选为 多糖合成功能缺失的H. mediterranei ESI。
[0022] 除上述碳源外，所述发酵培养基还包括：酵母提取物2~5g/L、钢离子1. 5~ 2. 6M、儀离子90~120mM、巧离子5~15mM、钟离子55~75mM、碳酸根1. 5~3. 5mM、儀离 子0. 1~4. 9mM、锭离子30~45mM、憐酸根0. 2~0. 4mM和微量元素溶液化-61ml/L。
[0023] 优选地，所述发酵培养基还包括：酵母提取物3g/L、钢离子1. 88M、儀离子106mM、 巧离子9mM、钟离子67mM、碳酸根2. 5mM、漠离子4mM、锭离子37. 5mM、憐酸根0. 3mM和微量元 素溶液化-61ml/L。
[0024] 所述微量元素溶液化-6含有锋离子2~4mM，儘离子1~2mM，棚酸根40~55mM， 钻离子6~lOmM，铜离子0. 5~1. 5mM，儀离子1~2mM，銷酸根1~2mM ;pH调节至3~4。 [00巧]优选地，所述微量元素溶液化-6含有锋离子3. 5mM，儘离子1. 6mM，棚酸根48. 6mM， 钻离子8. 4mM.铜离子0. 6mM，儀离子1. 6mM，銷酸根1. 3mM ;抑调节至3~4。
[0026] 根据本发明的第二方面，提供一种采用上述方法制备的P皿V共聚物。
[0027] 所述共聚物具有10~70mol %，优选25~55mol %的3-径基戊酸醋单体单元。
[0028] 所述共聚物的烙化洽A Hm低于50J/g，优选低于40J/g。
[0029] 所述共聚物的烙融溫度为150°C W下，优选145°C W下；热分解溫度为255°C W上， 优选为260°C W上，更优选为265°C W上。
[0030] 所述共聚物的重均分子量为500, 000 W上，优选为800, 000 W上。对于分子量的 上限，通常没有限制，但为了特定的用途可为例如500, 000~2, 000, 000,优选为800, 000~ 1，500, 000。
[0031] 所述共聚物的分子量分布为1. 1~1. 8,优选为1. 3~1. 5。
[0032] 本发明的方法采用戊酸盐（醋）作为微生物的碳源，通过控制加入碳源的浓度可 W控制P皿V共聚物中3HV的单体含量，从而达到调节共聚物性质的目的。一般来说，戊酸 盐（醋）的浓度越高，3HV的含量越高。而且通过分多次加入戊酸盐（醋）碳源的方式还可 更进一步地提高3HV的含量。W葡萄糖等糖类为碳源的常规发酵方法所获得的P皿V共聚 物中3HV的含量基本恒定。与此相比，本发明的方法可W对共聚物的组成进行有效调节，从 而可W获得所需性能的共聚物。
[0033] 由此，通过本发明的方法所获得共聚物，其3HV共聚单体的摩尔含量可在较大范 围内进行调节。而且性能优选的共聚物具有较低的烙化洽，其烙点明显低于常规方法获得 的共聚物。同时，本发明的共聚物的热分解溫度高