的效果 都很好，最低检出限均在IX IO4IlVml之下。
[0086] 实施例3试剂盒检测效果评价
[0087] 实验方法：
[0088] 1.样本处理：
[0089] 所用样本包括:HIV、皿V、HCV病人血清样本各2例，健康人血清样本2例。
[0090]上述血清样本均使用上海之江生物科技股份有限公司生产的核糖核酸(RNA)抽提 试剂盒(磁珠柱提取法)进行RNA提取。
[0091 ]磁珠法抽提病毒RNA试剂盒的组成成分如下表5:
[0092] 表 5
[0093]
LUUM」磁珠法抽提病韋RNA巧刑益的便用万法具体刃：
[00M]①准备试剂:洗涂液首次使用前，按瓶身说明加入乙醇并混匀，做好标记;磁珠使 用前振荡混匀，RNA助沉剂使用前振荡混匀；
[0096] ②按上表所述用量，将n人份的RNA助沉剂、磁珠、加入结合缓冲液，混匀；
[0097] ③从2中混匀的液体取52化1于1.5ml离屯、管中，每管加入14化1血清样品，混合后， 满旋振荡IOsec后静置3min;
[0098] ④将3中混匀静置好的体系转置于亲和株中，13000rpm离屯、40sec，弃去收集管废 液；
[0099] ⑤洗涂液A洗涂2次:加入50化1洗涂液A，1300化pm离屯、40sec，弃去收集管废液，再 重复一次；
[0100] ⑥洗涂液W洗涂2次:加入50化1洗涂液W ,1300化pm离屯、15sec，弃去收集管废液，再 重复一次；
[0101] ⑦亲和柱放入干净的1.5ml离屯、管，13000巧m离屯、2min，充分干燥
[0102] ⑧亲和柱放入RNAnase free的1.5ml离屯、管中，5化1洗脱液(预热至65°C)，室溫静 置2min，然后13000巧m离屯、2min洗脱核酸于离屯、管中，-20°C保存备用。
[0103] 2.配制PCR反应体系，如下表6所示：
[0104] 表6 「01051
LU l U6」 化伏化联个问巧型护」巧本共》/广，阴巧卿照/阳巧卿照化应脊一，共雨化打i U嘗 PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重巧光PCR检测混合液IOX 1化1，逆转录酶巧aq DNA聚合酶(4:6)10 X化1，振荡混匀并瞬时离屯、后取混合液分置于10个PCR反应管中， 最后向I~8号反应管中分别加入扣I待检样品的核酸提取液，9号管中加入化I IXlO6IU/ ml假病毒阳性对照样品，10号反应管中加入化1 DEPC-d地2〇作为阴性对照。加样完成后迅 速盖好管盖，进行PCR扩增反应。
[0107] 3. PCR 扩增
[0108] 此次PCR反应在SLAN-965Rea^Time巧光PCR仪上进行，反应条件设置为： (1 ) 4化 IOmin: (2) 9^ C 15 min；
[0109] C3) 95°C 15 sec；： (4) 60 C 60 see；
[0110] 步骤(3)-(4)循环45次;在循环中的60°C反应阶段进行单点巧光检测。
[0111] 阔值设定原则为：阔值线刚好超过阴性对照(DEPC-dd出0)的最高点。
[0112] 4.结果分析：
[011引各样本的扩增曲线如图4-巧Ij图4-10所示。
[0114] 实验结果如下表7所示：
[0115] 表7
[0116]
[0117] 如表中所示，在此次检测的样本中：1号为HIV，皿V混合感染，2号为HIV单阳性，3号 为皿V单阳性，4号为皿V，HCV混合感染，5号、6号均为HCV单阳性，7号、8号为健康人，各项检 测均为阴性，9号是阳性对照品，S个检测结果均为阳性，证明此次PCR扩增反应正常，巧光 检测系统正常；10号为阴性对照，S个检测结果均为阴性，证明此次PCR扩增反应无污染。上 述所有检测结果为阳性的样本均经过Sanger法测序验证无误，阳性结果准确率100%。可见 本试剂盒的检测结果具有很好的特异性和准确度。
[0118] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包括HI V检测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针，所述HI V检 测引物包括核苷酸如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下 游引物，HIV检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述HBV检测引物包括核苷酸如 SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的下游引物，HBV检测探针 的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述HCV检测引物包括核苷酸如SEQ ID NO.7所示的上 游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，HCV检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示;所述HIV检测探针、HBV检测探针和HCV检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬 灭基团。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HIV检测探针、HBV检测探针和 测探针的5 '端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述HIV检测探针5 '端标记的荧光报告 基团为FAM荧光基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述HBV检测探针5'端标记的荧光报告 基团为CY5荧光基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述HCV检测探针5 '端标记的荧光报告 基团为HEX荧光基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲 液、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、无菌水中的一种或多种。7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照 中的一种或多种。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有HIV特异性扩增片 段的假病毒、含有HBV特异性扩增片段的假病毒和含有HCV特异性扩增片段的假病毒。9. 如权利要求1~8任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤： (1) 提取样品核酸； (2) 加样:将样品核酸、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获 得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有如权利要求1~5 任一权利要求中PCR检测引物及探针； (3) PCR反应:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应； (4) PCR反应结束后，分析结果。10. 如权利要求1~8任一权利要求所述的试剂盒在制备人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病 毒、丙型肝炎病毒快速联检产品中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）快速联检试剂盒及其制备和应用。本发明所述试剂盒中包括HIV检测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针，使用多重荧光PCR技术，在单个PCR反应管中同时检测HIV,HBV,HCV三种病毒核酸，检测灵敏度高，特异性好，人工误差率低，实验耗时短；在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进行，降低了样本间交叉污染的风险，适合在大规模血液筛查和临床检验中应用。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/93
【公开号】CN105695631
【申请号】CN201610156854
【发明人】黄吉城, 李小波, 郑夔, 师永霞, 刘燕, 王宁, 王凯
【申请人】广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 上海之江生物科技股份有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月18日