在叶中具有改变量的一种或多种生物碱的烟草植物及使用此类植物的方法

在叶中具有改变量的一种或多种生物碱的烟草植物及使用此类植物的方法【专利摘要】本发明公开提供了涉及生物碱在烟草中从根到叶的转运的多个序列、使用此类序列的方法、携带对此类序列的修饰的烟草植物、以及从此类植物制造的烟草产品。【专利说明】在叶中具有改变量的一种或多种生物碱的烟草植物及使用此类植物的方法
技术领域：
[0001]本发明公开一般性地涉及烟草植物。[0002]背景[0003]人们一直试图培育低生物碱的烟草品种。然而，这样的品种大多生成低质量的叶，尚无具有降低的叶生物碱含量的商业烟草品系。因此，需要鉴定这样的烟草基因，可调变其表达使得烟叶中的生物碱概貌，尤其是叶的烟碱类生物碱概貌能够得以改变。[0004]概述[0005]描述了涉及生物碱在烟草中从根到叶的转运的多个序列。还描述了使用这类序列的方法。[0006]在一个方面，提供了烟草杂种、品种、品系、或栽培种。这样的烟草杂种、品种、品系、或栽培种包括具有在诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的一个或多个内源核酸中的突变的植物。在一些实施方案中，来自所述植物的烟叶相对于来自缺乏突变的植物的烟叶展现出至少一种生物碱的量降低。在一些实施方案中，来自所述植物的调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)的量降低。还提供了由这样的烟草杂种、品种、品系、或栽培种产生的种子，其中所述种子包括在具有诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列的一个或多个内源核酸中的突变。[0007]在另一方面，提供了产生烟草植物的方法。这样的方法一般包括下列步骤:在普通烟草(Nicotianatabacum)细胞中诱导突变以产生诱变细胞，从该诱变细胞获得一株或多株植物，和从所述植物中鉴定包含在诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的一个或多个内源核酸中的突变的至少一株植物。这种方法可进一步包括鉴定至少一株包含显示至少一种生物碱的量降低的叶(相对于来自缺乏突变的植物的叶）的植物。这种方法还可包括鉴定至少一株这样的植物，其中所得的调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种TSNA量降低。[0008]诱变可使用化学诱变剂或电离辐射来诱导。代表性的化学诱变剂包括但不限于，亚硝酸、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙锭、和乙基甲磺酸(EMS)。代表性的电离辐射包括但不限于，X射线、γ射线、快中子照射、和UV照射。可以使用TALEN或锌指技术诱导突变。[0009]在另一方面，提供了生产烟草植物的方法。这种方法也包括使第一烟草品系的至少一株植物与第二烟草品系的至少一株植物杂交以及选择具有突变的后代烟草植物的步骤。通常，第一烟草品系的植物在一个或多个内源核酸中，诸如具有SEQIDN0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列的内源核酸中具有突变。这种方法可进一步包括选择具有展现出至少一种生物碱量降低的叶(相对于来自缺乏突变的植物的叶）的后代烟草植物。这种方法还可包括选择其中调制叶展现出至少一种TSNA量降低(相对于来自缺乏突变的植物的调制叶）的后代烟草植物。[0010]在另一方面，提供了烟草产品。这种烟草产品一般包括来自这样的烟草植物的调制叶，所述烟草植物在一个或多个内源核酸中，例如在具有SEQIDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列的一个或多个内源核酸中具有突变。在一些实施方案中，所述烟草产品内包含的调制叶相对于包含在来自缺乏突变的植物的烟草产品内的调制叶展现出至少一种生物碱的量降低。在一些实施方案中，所述烟草产品内的调制叶相对于包含在来自缺乏突变的植物的烟草产品内的调制叶展现出至少一种TSNA的量降低。[0011]在另一方面，提供了生产烟草产品的方法。这种方法通常包括提供来自烟草植物的调制叶，以及利用所述调制叶制造烟草产品，所述烟草植物在一个或多个内源核酸中，例如具有如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列中具有突变。在一些实施方案中，所述调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种生物碱的量降低。在一些实施方案中，所述调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种TSNA的量降低。[0012]如本文中所述的突变可以是，但不限于，点突变、插入、缺失、或取代。[0013]在又一个方面，提供了包含植物表达载体的转基因烟草植物。一般来说，表达载体包含至少25个核苷酸的长度并且与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列具有至少91%序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，相对于来自不表达所述核酸分子的烟草植物的叶，核酸分子的表达导致叶展现出至少一种生物碱的量降低。在一些实施方案中，相对于来自不表达所述核酸分子的烟草植物的调制叶，核酸分子的表达导致调制叶展现出至少一种TSNA的量降低。还提供了由这种转基因烟草植物产生的种子，其中种子包含所述表达载体。[0014]在一个方面，提供了转基因烟草植物，其包含长度至少为25个核苷酸的异源核酸分子，其中所述核酸分子在严格条件下与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列杂交。在一些实施方案中，所述异源核酸分子的表达导致叶展现出至少一种生物碱的量降低(相对于来自不表达该异源核酸分子的烟草植物的叶）。在一些实施方案中，所述异源核酸分子的表达导致调制叶展现出至少一种TSNA的量降低(相对于来自不表达该异源核酸分子的烟草植物的调制叶）。还提供了由此类转基因烟草植物产生的种子，其中所述种子包含所述异源核酸分子。[0015]在一个方面，提供了包含载体的来自转基因烟草植物的叶。通常，载体包含与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列的25个或更多个连续核苷酸具有至少91%序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子的表达导致叶展现出至少一种生物碱的量相对于来自不表达所述核酸分子的烟草植物的叶降低。在一些实施方案中，核酸分子的表达导致调制叶展现出至少一种TSNA的量相对于来自不表达所述核酸分子的烟草植物的调制叶降低。[0016]在另一方面，提供了产生转基因植物的方法。这样的方法一般包括在植物中表达转基因。所述转基因编码抑制诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列表达双链RNA分子。所述双链RNA分子包含与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列具有至少91%或更大的序列同一性的至少25个连续核苷酸。在一些实施方案中，，转基因的表达导致植物的叶展现出至少一种生物碱的量相对于来自不表达所述转基因的植物的叶降低。在一些实施方案中，转基因的表达导致调制叶展现出至少一种TSNA的量相对于来自不表达所述核酸分子的植物的调制叶的降低。在一些实施方案中，双链RNA分子具有诸如SEQIDNO:51-56的序列。[0017]在另一方面，提供了改变烟草植物中的叶成分的方法。这种方法通常包括将与启动子可操作连接的异源核酸分子导入烟草细胞中产生转基因烟草细胞、以及从所述转基因烟草细胞再生转基因烟草植物的步骤。一般来说，所述异源核酸分子包含至少25个核苷酸的长度并且与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列具有至少91%序列同一性。这样的转基因烟草植物展现出改变的叶成分。这样的方法可进一步包括选择至少一株这样的转基因烟草植物，该植物具有展现出至少一种生物碱的量降低(相对于来自不表达异源核酸分子的烟草植物的叶）的叶。此类方法可进一步包括选择至少一株这样的转基因烟草植物，该植物的调制叶展现出至少一种TSNA的量降低(相对于来自不表达异源核酸分子的烟草植物的调制叶）。[0018]在另一方面，提供了包含载体的来自转基因烟草植物的调制烟叶。通常，载体包含与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列的25个或更多个连续核苷酸具有至少91%序列同一性（例如，至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性）的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子的表达导致叶展现出至少一种生物碱的量降低（相对于来自不表达所述核酸分子的烟草植物的叶）。在一些实施方案中，核酸分子的表达导致调制叶展现出至少一种TSNA的量降低（相对于来自不表达所述核酸分子的烟草植物的调制叶）。在一些实施方案中，所述核酸呈有义取向，而在一些实施方案中，所述核酸呈反义取向。[0019]在又另一个方面，提供了包含植物表达载体的转基因烟草植物。通常，表达载体包含与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的序列、或与这些序列的编码功能多肽的任何片段具有至少95%序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，相对于来自不表达所述核酸分子或其功能片段的烟草植物的叶，核酸分子或其功能片段的表达导致叶展现出至少一种生物碱的量增加。还提供了由这种转基因烟草植物产生的种子，其中所述种子包含所述表达载体。[0020]在另一个方面，提供了包含异源核酸分子的转基因烟草植物。通常，所述核酸分子在严格条件下与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其编码功能多肽的片段杂交。在一些实施方案中，异源核酸分子或其功能片段的表达导致叶相对于来自不表达异源核酸分子或其功能片段的烟草植物的叶展现出至少一种生物碱的量增加。还提供了由这种转基因烟草植物产生的种子，其中所述种子包含异源核酸分子。[0021]在一个方面，提供了包含载体的来自转基因烟草植物的叶。典型地，此类载体包含与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其编码功能多肽的片段具有至少95%序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子或其功能片段的表达导致叶相对于来自不表达所述核酸分子或其功能片段的烟草植物的叶展现出至少一种生物碱的量的增加。[0022]在另一方面，提供了改变烟草植物中的叶成分的方法。此类方法一般包括将与启动子可操作连接的异源核酸分子导入烟草细胞中产生转基因烟草细胞、以及从所述转基因烟草细胞再生转基因烟草植物的步骤，其中所述转基因植物具有改变的叶成分。所述异源核酸分子一般与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其编码功能多肽的片段具有至少95%的序列同一性。此类方法可进一步包括选择至少一株这样的转基因烟草植物:该植物具有相对于来自不表达异源核酸分子或其功能片段的烟草植物的叶展现出至少一种生物碱的量增加的叶。在一些实施方案中，使用粒子轰击、土壤杆菌介导的转化、显微注射、聚乙二醇介导的转化、脂质体介导的DNA摄取、或电穿孔，将异源核酸分子导入烟草细胞中。[0023]在一个方面，提供了包含载体的来自转基因烟草植物的调制烟叶。一般来说，所述载体包含与诸如SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90的核酸序列、或其编码功能多肽的片段具有至少95%序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子或其功能片段导致烟叶相对于来自不表达所述核酸分子或其功能片段的烟草植物的叶展现出至少一种生物碱的量增加。[0024]代表性的生物碱包括但不限于，烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明(myosmine)、和新烟草碱。一般来说，采用高效液相色谱(HPLC)-质谱法(MS)或高效薄层色谱法(HPTLC)确定一种或多种生物碱的量。[0025]适合于在本文中描述的方法中使用的烟草植物可以是白肋烟型(Burleytype)、深色型（darktype)、烤烟型（flue-curedtype)、马里兰型（Marylandtype)、或东方型(Orientaltype)。适合于在本文中描述的方法中使用的烟草植物一般来自普通烟草，并且可来自任何数目的普通烟草品种。品种可以是BU64、CC101、CC200、CC13、CC27、CC33、CC35、CC37、CC65、CC67、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、CC1063、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CU263、DF911、Galpao烟草、GL26H、GL338、GL350、GL395、GL600、GL737、GL939、GL973、GF157、GF318、RJR901、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925、PVH1118、PVH1452、PVH2110、PVH2254、PVH2275、VA116、VA119、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、ΚΤΥ14χL8LC、LittleCrittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、NarrowLeafMadole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NCBH129、NC2002、NealSmithMadole、OXFORD207、'Perique'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-11、R7-12、RG17、RG81、RGH51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、SpeightG_28、SpeightG-70、SpeightH-6、SpeightH20、SpeightNF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC、TND94、TND950、TR(TomRosson)Madole、VA309、或VA359〇[0026]在另一方面，提供了筛选植物的方法。此类方法一般包括提供来自如本文所述的突变植物的植物材料，和确定植物组织中一种或多种生物碱的量。在一些实施方案中，植物组织为叶。在一些实施方案中，植物组织为根。此类方法可进一步包括确定植物组织中一种或多种TSNA的量。[0027]除非另外定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语具有与主题方法和组合物所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。下文中描述了合适的方法和材料，但类似于或等同于本文中所描述者的方法和材料也可以用于实施或测试主题方法和组合物。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并且不意图构成限定。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过提述完整并入。【附图说明】[0028]图1为本文中所述的新Nup序列与先前已知的普通烟草Nupl和Nup2的比对。Nupl预测的跨膜螺旋由方框表示。[0029]图2为本文中描述的四种新的MDR序列与代表性MDR多肽(登录号XP_004233862)的比对。加框的区域表示保守性ATP酶结构域。[0030]图3为新的MATE序列与普通烟草MATE1的比对。方框指示预测的跨膜结构域;预测的N端定位显示为阴影，其中预测的保守性切割位点以箭头示出。[0031]图4A为新的MDR序列之一的C11099与来自番茄的推定的ABC转运蛋白B家族成员8类似物的比对，图4B为鉴定的其他转运蛋白序列之一的C43677与来自番茄的双向糖转运蛋白SWEET12类似物的比对。[0032]图5为显示花烟草和普通烟草的叶和根中烟碱的量的曲线图。[0033]图6为用于在如本文所述的转基因植物中表达RNAi分子的构建体的示意图。[0034]图7为用于TALEN诱变的构建体的示意图。[0035]图8A为在采用浮盘方案进行烟碱补料之后叶和根烟碱含量的比率，图8B为个体植物的根和叶烟碱含量。[0036]图9A为在采用无底盆补料方案进行烟碱补料之后个体植物的叶烟碱含量，图9B为相同植物在补料前后的叶烟碱含量。[0037]发明详述[0038]先前人们修饰产生低生物碱烟草品种的途径的尝试有时导致叶的质量较低。目前尚不存在这样的商业烟草品系，其具有降低的叶生物碱含量，而与含有标准生物碱含量的调制叶(例如，来自野生型烟草植物的叶)相比，又能提供相同质量的调制叶。[0039]本公开的基础是从普通烟草发现了编码生物碱转运蛋白和调节多肽的新核酸。在本文中描述和表征了这些核酸SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90以及由它们编码的多肽SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91。在此发现的基础上，可在普通烟草中调变这些核酸序列的表达水平和/或这些多肽的功能，并评估由此对植物中生物碱转运的影响。调变多肽功能和/或基因表达可改进烟叶和所得烟草产品中的生物碱组成的控制。[0040]核酸和多肽[0041]本文中提供了新的核酸(参见，例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)。如本文中使用的，核酸可包括DNA和RNA，并且包括含有一种或多种核苷酸类似物或骨架修饰的核酸。核酸可以是单链或双链的，一般取决于其预期用途。本文中提供的新的核酸编码新的多肽（参见，例如，SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91)。[0042]还提供了分别与SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90不同的核酸以及与SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91和不同的多肽。与SEQIDN0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、S90#&SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91在序列上不同的核酸和多肽可分别与SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、S90#&SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91具有至少50%序列同一性（例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性）。[0043]在计算序列同一性百分比时，将两个序列比对，并确定两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配数。相同匹配数除以比对区域的长度（即，比对的核苷酸或氨基酸的数目），然后乘以1〇〇,得到序列同一性百分比的值。应当理解的是，比对区域的长度可以是一个或两个序列的一部分，至多为最短序列的全长大小。同样应当理解的是，单个序列可与一个以上的其他序列比对，因此在每个比对的区域上可具有不同的序列同一性百分比的值。[0044]可以使用计算机程序ClustalW和缺省参数进行两个或更多个序列的比对来确定序列同一性百分比，ClustalW可以让核酸或多肽序列在序列全长上进行比对(全局比对）。Chenna等人，2003，NucleicAcidsRes.,31(13):3497_500<Χ1ι?8?&1?计算出查询序列与一个或多个主题序列之间的最佳匹配，将它们进行比对，如此可确定同一性、相似性和差异。在查询序列和/或主题序列中可插入一个多个残基空位，使序列比对最大化。对于核酸序列的快速两两比对，可使用缺省参数（即，字大小:2;窗口大小:4;评分方法:百分比;顶对角线数:4;和空位罚分:5);对于多个核酸序列的比对，可使用下列参数:空位开放罚分:10.0;空位延伸罚分:5.0;和加权转变:是。对于多肽序列的快速两两比对，可使用下列参数:字大小：1;窗大小:5;评分方法:百分比；顶对角线数:5;和空位罚分:3。对于多肽序列的多重比对，可使用下列参数:权重矩阵:blosum;空位开放罚分：10.0;空位延伸罚分:0.05;亲水空位:开启；亲水残基:617、？1'〇、561'、48]1、48口、6111、6111、4找、和1^8;以及残基特异性空位罚分：开启。例如，可以万维网上的的贝勒医学院检索网站（BaylorCollegeofMedicineSearchLauncherwebsite)和欧洲生物信息学研究所网站（EuropeanBioinformaticsInstitutewebsite)运行ClustalWo[0045]可在核酸分子(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中导入变化，由此导致所编码的多肽的氨基酸序列（例如，SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、或91)的变化。例如，可采用诱变(例如，定点诱变、PCR介导的诱变），或通过化学合成具有此类变化的核酸分子而在核酸编码序列中导入变化。这种核酸变化可导致一个或多个氨基酸残基处的保守和/或非保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是其中用具有相似侧链的不同氨基酸残基替换一个氨基酸残基的取代(参见，例如Dayhoff等人（1978,inAtlasofProteinSequenceandStructure，5(Suppl·3):345-352)，其提供了氨基酸取代的频率表），而非保守取代是其中用没有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。[0046]如本文中使用的，"分离的"核酸分子是这样的核酸分子(例如，cDNA或通过PCR或限制性核酸内切酶消化所产生的基因组DNA片段）：其游离于在该分离核酸分子所来源的生物基因组中的天然位于该核酸分子一端或两端的侧翼的序列。这种分离的核酸分子通常被导入载体(例如，克隆载体、或表达载体）中，以便于操作或产生融合核酸分子，这将在下文更详细地论述。另外，分离的核酸分子可包括工程化的核酸分子，如重组和合成的核酸分子。[0047]如本文中使用的，"纯化的"多肽是已从天然地伴随它的细胞组分中分离或纯化出来的多肽。一般来说，当多肽按干重计至少70%(例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%)游离于与其天然伴随的多肽或天然存在分子时，其被视为是"纯化的"。由于化学合成的多肽自然地与天然伴随它的组分相分离，所以合成多肽是"纯化的"。[0048]可使用本领域中的常规技术分离核酸。例如，可使用任何方法分离核酸，所述方法包括但不限于，重组核酸技术、和/或聚合酶链反压(PCR)。通用的PCR技术描述于例如PCRPrimer:ALaboratoryManual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。重组核酸技术包括例如，限制酶消化和连接，其可用于分离核酸。还可化学合成分离的核酸，其形式为单个核酸分子或为一系列寡核苷酸。[0049]可通过已知的方法如DEAE离子交换、凝胶过滤、和羟基磷灰石色谱法，从天然来源(例如，生物样品）中纯化多肽。还可以通过例如在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，可通过化学合成获得纯化的多肽。可以采用任何适当的方法，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量多肽的纯度范围。[0050]还提供了含有核酸(例如，编码多肽的核酸）的载体。可商购或可通过本领域中常规的重组DNA技术产生载体，包括表达载体。含有核酸的载体可具有与这种核酸可操作连接的表达元件，并可进一步包括编码选择标志物(例如，抗生素抗性基因）的序列。含有核酸的载体可编码嵌合或融合多肽（即，与异源多肽可操作连接的多肽，其可以在多肽的N端或C端）。代表性异源多肽为可在编码的多肽的纯化中使用的那些多肽(例如，6xHis标签，谷胱甘肽S转移酶(GST))。[0051]表达元件包括指导和调节核酸编码序列的表达的核酸序列。表达元件的一个实例是启动子序列。表达元件还可包括调节核酸表达的内含子、增强子序列、反应元件、或诱导型元件。表达元件可以是细菌、酵母、昆虫、哺乳动物、或病毒来源的，并且载体可以含有不同来源的元件的组合。如本文中使用的，可操作连接意指启动子或其他表达元件相对于核酸以指导或调节核酸表达的这样一种方式位于载体中（例如，合框）。众多将核酸导入宿主细胞中的体内和体外方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙二醇(PEG)转化、热激、脂质体转染、显微注射、和病毒介导的核酸转移。[0052]如本文中描述的载体可导入宿主细胞中。如本文中使用的，"宿主细胞"是指核酸导入其中的特定细胞，并且也包括携带载体的这种细胞的后代。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，核酸可以在诸如大肠杆菌的细菌细胞中、或在昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中华仓鼠卵巢细胞(CH0)或C0S细胞）中表达。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员已知的。[0053]可以利用适当的寡核苷酸对（例如，引物）使用许多扩增技术检测核酸（参见，例如，PCRPrimer:ALaboratoryManual，1995，Dieffenbach&Dveksler，Eds·，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY;和美国专利Nos.4,683,195;4,683，202;4，800，159;和4，965，188)。针对原始PCR的许多改良已经产生并可用来检测核酸。[0054]还可利用杂交来检测核酸。核酸之间的杂交由Sambrook等人详细论述（1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY;部分7.37-7.57、9.47-9.57、11.7-11.8、和11.45-11.57)〇Sambrook等人公开了针对小于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的适当的Southern印迹条件(部分11.45-11.46)。利用部分11.46中提供的公式，可以计算出在长度小于100个核苷酸的序列与第二序列之间的Tm。Sambrook等人另外公开了针对大于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的适当的Southern印迹条件（参见部分9.47-9.54)。利用Sambrook等人在部分9.50-9.51中提供的公式，可以计算出在长度大于100个核苷酸的序列与第二序列之间的Tm。[0055]含有核酸的膜预杂交和杂交的条件、以及洗涤含有核酸的膜以去除过量的和非特异性结合的探针的条件可在杂交严格性中起着重要作用。适当时，可以在中等或高严格条件下进行这样的杂交和洗涤。例如，通过降低洗涤溶液中的盐浓度和/或通过增加进行洗涤时的温度，可以使洗涤条件更严格。仅仅作为举例，高严格条件一般包括在0.2XSSC中在65°(：洗涤膜。[0056]另外，杂交量的解释可受到例如标记的寡核苷酸探针比活性、与探针杂交的模板核酸上的探针结合位点的数目、以及放射自显影片或其他检测介质的暴露量的影响。本领域普通技术人员容易理解的是，虽然可以采用许多杂交和洗涤条件来检验探针核酸分子与固定的靶核酸的杂交，更重要的是检验在相同杂交、洗涤、和暴露条件下探针与靶核酸的杂交。优选的是，靶核酸在同一张膜上。[0057]如果核酸分子与一种核酸的杂交比与另一种核酸的杂交多至少5倍(例如，至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、或100倍），则所述核酸分子被认为与这种核酸而不是与所述另一种核酸杂交。可直接在膜上或使用例如Phosphorlmager或Densitometer(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)从放射自显影片对杂交量进行定量。[0058]可使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、WeStern印迹、免疫沉淀和免疫荧光。抗体可以是多克隆或单克隆的。可以利用本领域中熟知的方法产生对多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可利用本领域已知的方法将抗体附接到诸如微量滴定板的固体支持物上。在多肽的存在下，形成抗体-多肽复合物。[0059]通常利用可检测标记来完成检测（例如，扩增产物、杂交复合物、或多肽的检测）。术语"标记"旨在涵盖直接标记以及间接标记的使用。可检测标记包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、和放射性物质。[0060]本文中描述的某些核酸(例如，SEQIDN0:1、3、5、7、或82)预期编码属于烟碱摄取通透酶(nicotineuptakepermease,Nup)序列家族的多肽（例如，SEQID腸：2、4、6、8、或83)Jup多肽是更大的嘌呤通透酶家族的成员。参见，例如，Hildreth等人，2011，PNASUSA，108:18279-84。除了本文中公开的新的Nup核酸和多肽序列之外，来自普通烟草的代表性Nupl和Nup2序列显示在登录号⑶174268.1和⑶174267.1中。[0061]本文中描述的某些核酸(例如，SEQID^):9、11、13、15、70、72、74、76、78、或80)预期编码属于多药耐药(MDR)序列家族的多肽(例如，SEQIDN0:10、12、14、16、71、73、75、77、79、或81)。多药转运蛋白构成一大类膜蛋白，存在于大多数生物的细胞中。这些蛋白结合多种具有潜在细胞毒作用的化合物，并通过一个ATP或质子依赖性的过程将它们从细胞中去除（Zhelenova等人，2000，TrendsBiochem.Sci·，25:39-43)。从前将多药转运蛋白划分为四个超家族:ATP结合盒(ABC)超家族、主要协助转运蛋白超家族、小多重耐药家族、耐药节结化细胞分化家族(下文更详细地论述的MATE家族最近被鉴定为多药转运蛋白的第五超家族）。属于ATP结合盒超家族和主要协助转运蛋白超家族的外排栗蛋白是多药耐药性(MDR)的最突出的促成因素。[0062]本文中描述的某些核酸（例如，SEQIDN0:17、19、21、23、25、27、29、31、86、88、或90)预期编码属于多药和毒性化合物外排型(MATE)序列家族的多肽(例如，SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、87、89、或91)。MATE多肽家族的特征是:存在12个推定的跨膜区段，以及不存在对其他多药转运蛋白超家族特异的"特征序列"（Brown等人，1999，Mol.Microbiol.，31:394-5)JATE蛋白被认为用作质子依赖性外排转运蛋白，在细菌和植物中大量存在。[0063]本文中描述的某些核酸（例如，SEQIDN0:33和35)预期编码属于多向耐药性(PDR)序列家族的多肽（例如，SEQID^):34和36)。参见，例如，]?〇〇118,2008，？131^3,229:53-711DR家族仅发现于真菌和植物中，最初在酿酒酵母中由于编码非特异性药物外排转运蛋白的基因的表达增加而得以被表征。已鉴定了若干TOR多肽，它们赋予对一大组在功能和结构上不相关的毒性化合物(例如，抗真菌和抗癌药物）的抗性，并转运弱有机酸。另外，已在若干植物物种(包括，例如，拟南芥和水稻）中鉴定了多种TOR基因。[0064]具有降低的叶中生物碱量的植物及制造方法[0065]提供了在一种或多种如本文中描述的内源核酸(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突变的烟草杂种、品种、品系、或栽培种。来自在一种或多种内源核酸（例如，SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突变的植物的叶可展现出至少一种生物碱量的降低(例如，与来自没有所述突变的植物的叶相比）。另外，来自在一种或多种内源核酸（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突变的植物的叶可展现出至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)量的降低(例如，与来自没有所述突变的植物的叶相比）。[0066]本文中提及的生物碱一般包括吡啶生物碱类，包括烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明、和新烟草碱。参见，例如，Sheng等人，2005，Chromatographia，62:63-8JSNA在调制过程中产生。亚硝酸盐可能由于细菌还原硝酸盐而累积，而亚硝酸盐(亚硝基化物质的来源）与生物碱之间发生化学反应而形成TSNA。代表性TSNA包括，例如，Ν'-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N'_亚硝基新烟草碱(NAT)、N'_亚硝基新烟碱(NAB)、和4-(甲基亚硝基氨基)-卜(3-吡啶基)-1-丁醛(NNAL)。[0067]检测生物碱或TSNA的方法以及确定一种或多种生物碱或TSNA量的方法是本领域已知的。例如，可采用高效液相色谱（HPLC)-质谱法（MS)(HPLC-MS)或高效薄层色谱法(HPTLC)来检测一种或多种生物碱的存在和/或确定一种或多种生物碱的量。另外，可采用多种色谱方法(例如，气相色谱/热能分析(GC/TEA)、液相色谱/质谱法(LC/MS)、和离子色谱法（1C))来检测一种或多种TSNA的存在和/或确定一种或多种TSNA的量。[0068]制造具有突变的烟草植物的方法是本领域已知的。突变可以是随机突变或靶向突变。对于随机诱变，可使用例如化学诱变剂、电离辐射、或快中子轰击使细胞(例如，普通烟草细胞)诱变(参见，例如，Li等人，2001，PlantJ.,27:235-42)。代表性化学诱变剂包括但不限于，亚硝酸、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙锭、和甲磺酸乙酯(EMS)，而代表性电离辐射包括但不限于，X射线、γ射线、快中子照射、和UV照射。针对每种植物组织类型以实验方式确定诱变性化学品或辐射的剂量，以获得在阈值水平（以致死或生殖不育为特征）以下的突变频率。基于预期的突变频率，估计诱变处理所产生的％代种子的数目或％植物群的大小。对于靶向诱变，代表性技术包括TALEN(参见，例如，Li等人，2011，NucleicAcidsRes.,39(14):6315-25)或锌指（参见，例如，Wright等人，2005，ThePlantJ.,44:693-705)。无论是随机还是靶向，突变可以是点突变、插入、缺失、取代、或其组合。[0069]多肽中的保守结构域对于多肽的功能以及细胞或亚细胞定位可能是重要的。图1显示了包括本文描述的新Nup序列在内的若干Nup序列的比对，其中方框指示预测的跨膜螺旋。图2显示了包括本文中描述的新MDR序列在内的若干MDR序列与方框所指示的保守性ATP酶结构域的比对。图3显示了包括本文中描述的新的MATE序列在内的若干MATE序列的比对。图3中的方框指示预测的跨膜结构域，其中预测的N端信号肽显示为阴影，预测的保守性切害酸点以箭头示出。另外，图4A显示了在新的MD序列之一的C11099与来自番茄的推定的ABC转运蛋白B家族成员8类似物序列之间的比对。如下文表5中所示的，这些序列在核苷酸水平上具有84%序列同一性，且在氨基酸水平上具有85%序列同一性。此外，图4B显示了在下述二者之间的比对:标示为"其他"转运蛋白序列的一种新序列C43677,与来自番茄的双向糖转运蛋白SWEET12类似物序列。如下文表8中所示，这些序列在核苷酸水平上的具有71%序列同一性，在氨基酸水平上具有67%序列同一性。[0070]如本文中论述的，可以使一个或多个核苷酸突变，使得编码的多肽的表达和/或功能相对于相应的野生型多肽的表达和/或功能发生改变。应当理解的是，例如，在一个或多个高度保守区域(参见，例如，在图1、2、3、和4中所示的比对）中的突变很可能会改变多肽的功能，而在这些保守区域之外的突变很可能对多肽功能影响很小或没有影响。另外，单个核苷酸突变可产生终止密码子，导致截短的多肽，并且取决于截短的程度，可导致功能丧失。[0071]优选地，在本文中公开的新核酸之一中的突变导致包含所述突变的烟草植物中的转运蛋白活性降低或甚至完全消除。转运蛋白编码序列中的突变的适合类型包括但不限于，核苷酸的插入、核苷酸的缺失、或野生型转运蛋白编码序列中的转换或颠换。编码序列中的突变可导致一个或多个氨基酸的插入、一个或多个氨基酸的缺失、和/或在编码的多肽中的非保守氨基酸取代。在一些情况下，转运蛋白的编码序列包含一个以上的突变或一种以上类型的突变。[0072]例如，编码序列中的氨基酸插入或缺失可能破坏所编码的多肽的构象。氨基酸插入或缺失还可能破坏对于识别结合配体（即，被转运的分子)或对于多肽的活性（即，转运蛋白活性)而言重要的部位。本领域已知，与较小量的氨基酸插入或缺失相比，较大量的连续氨基酸插入或缺失更可能致使基因产物无功能。另外，一个或多个突变(例如，点突变)可改变转运蛋白多肽的定位、导入终止密码子以产生截短的多肽、或破坏多肽内的活性部位或结构域(例如，催化部位或结构域、结合部位或结构域）。[0073]仅仅作为举例，MATE转运蛋白序列（例如，图3;例如，C9954(SEQIDN0:26)、C46276(SEQIDN0:22)、C48594(SEQIDN0:24)、和DC38072(SEQIDN0:20))可被突变，将残基24处的带电氨基酸改变为不带电氨基酸。这样的突变可破坏转运多肽通常向细胞表面上的靶向，从而可改变一种或多种生物碱在植物内的转运(例如，进入木质部和/或从根到叶的转运）。另外，MDR转运蛋白（例如，Cl1099(SEQIDNO:16))可被突变使得核苷酸124处的T改变为A，从而在第八个氨基酸残基之后产生终止密码子。这样的突变将会显著降低或基本上消除植物中的转运蛋白多肽;可类似地对本文中公开的任何转运蛋白序列施加导入终止密码子的突变。此外，MDR(例如，图2和4A)和PDR(例如，SEQIDN0:33-36)多肽家族的转运需要ATP水解;ATP酶结构域是高度保守的，并且水解需要的氨基酸残基是已知的（例如，位于图2的残基676-682处的WalkerA氨基酸基序(GXXGXGK))。因此，MDR多肽（例如，DC3222(SEQIDN0:10)、C11099(SEQIDN0:16)、DC62783(SEQIDN0:12)JPDC26451(SEQIDN0:14))或PDR多肽（例如，C53160(SEQIDN0:34)、C22474(SEQIDN0:36))可在WalkerA基序内突变(例如，在保守赖氨酸(K)氨基酸处），结果将产生不能水解ATP并且不能进行转运或至少缺乏转运能力的多肽。[0074]对于非保守氨基酸取代，一种类型的氨基酸可替换为不同类型的氨基酸。非保守取代可实质性地改变基因产物的电荷或疏水性。非保守氨基酸取代还可实质性地改变残基侧链的体积，例如，将丙氨酸残基取代为异亮氨酸残基。非保守取代的实例包括碱性氨基酸取代为非极性氨基酸，或极性氨基酸取代为酸性氨基酸。[0075]转运蛋白多肽等跨膜多肽含有决定所述多肽定位在细胞内何处的特定序列。例如，先前描述的MATE1蛋白含有将其靶向到液泡上的序列，而本文描述的新MATE序列具有不同的N端结构域(参见图3中的比对）。在多肽插入膜之后，靶肽序列常常被切割(例如，通过识别特异性核苷酸基序的特异性蛋白酶）。通过突变靶序列或切割基序，可以改变多肽的靶向。[0076]诱变之后，从诱变的细胞再生Mo植物，并且可以筛选这些植物或这个群体的后续世代(例如，MhMhMs，等)在感兴趣序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中的突变。可以使用本领域中的常规方法(例如，杂交、扩增、其组合)或通过评估表型（例如，检测和/或确定根和/或叶中的一种或多种生物碱和/或一种或多种TSNA的量)筛选携带感兴趣序列中的突变的植物。通常，与缺乏突变的相应植物(例如，具有相同品种背景者)相比，在本文中公开的一个或多个核酸序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中存在突变导致突变植物的叶中一种或多种生物碱和/或突变植物的调制叶中一种或多种TSNA的降低。[0077]如本文中使用的，"降低的"或"降低"是指相对于来自缺乏突变的烟草植物的类似处理的烟叶（例如，青的或调制的），在青叶或调制叶中一种或多种生物碱、和/或青叶或调制叶中一种或多种TSNA的量减少(例如，统计学显著性减少）至少约5%到约95%(例如，约5%到约10%、约5%到约20%、约5%到约50%、约5%到约75%、约10%到约25%、约10%到约50%、约10%到约90%、约20%到约40%、约20%到约60%、约20%到约80%、约25%到约75%、约50%到约75%、约50%到约85%、约50%到约95%、以及约75%到约95%)。如本文中使用的，统计显著性是指采用统计显著性的适当量度时（例如，单尾双样本t检验）的p值小于0.05，例如，p值小于0.025或p值小于0.01。[0078]111烟草植物对于突变等位基因来说可以是杂合且展现出野生型表型。在这样的情况下，这种植物的第一代自花授粉后代的至少一部分展现出野生型表型。或者，草植物可具有突变体等位基因并展现出突变体表型。这样的植物可以是杂合的，但由于诸如负显性抑制之类的现象，尽管存在野生型等位基因亦展现出突变体表型；或者由于在两个等位基因中的独立诱导的突变，这样的植物可以是纯合的。[0079]携带突变体等位基因的烟草植物可在植物育种计划中使用，以建立新的且有用的栽培种、品系、品种和杂种。因此，在一些实施方案中，使含有至少一个突变的％、M2、M3或更后的世代的烟草植物与第二普通烟草植物杂交，并鉴定出其中存在突变的杂交后代。应当理解的是，第二普通烟草植物可以是本文中描述的物种和品种之一。还应当理解的是，第二普通烟草植物可含有与其杂交的植物相同的突变、不同的突变、或在该基因座处为野生型。另外地或可替代地，第二烟草品系可展现出表型性状，如抗病性、高产量、高分级指标、可烤性(curabi1ity)、烘烤质量、机械收割、保持能力、叶子质量、高度、植物成熟(例如，早期成熟、早期到中期成熟、中期成熟、中期到晚期成熟、或晚期成熟）；茎长(例如，短、中等的或长茎）；和/或每株植物的叶子数量(例如，叶子数量少(例如5-10片叶子）、中等(例如11-15片叶子）、或多(例如16-21片叶子）。[0080]采用已知的程序进行育种。可以在标记辅助选择(MAS)育种计划中采用DNA指纹图谱、SNP或类似技术，将突变体基因转移到或选育到如本文中所述的其他烟草中。可采用本文中描述的方法筛查杂交后代是否有突变，并且可以选择在本文描述的核酸序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中具有突变的植物。例如，可使用本文中列出的技术之一，采用从本文中描述的序列或其片段开发的标记来筛选F2S回交世代植物。还可以筛选来自后代植物的叶(青的或调制的，视情况而定）的一种或多种生物碱和/或一种或多种TSNA的量，并可选择相比于缺乏突变的相应植物具有降低量的那些植物。鉴定为具有突变体等位基因和/或突变体表型的植物可以回交或自花授粉，以建立第二种群供筛选。可以重复回交或其他育种程序，直到轮回亲本的期望表型得以回收时为止。[0081]成功的回交产生能育的并在需要时可与亲本之一回交的Fi植物。在一些实施方案中，利用标准方法(例如，采用基于本文中公开的核酸序列的引物的PCR)筛选F2世代中的植物种群是否有突变或变体基因表达。然后使选出的植物与亲本之一杂交，并使第一回交(BQ)世代植物自花授粉以产生B&F2种群，对该种群再次筛选变体基因表达。重复回交、自花授粉、和筛选的过程，例如至少重复四次，直到最后筛选产生能育的并与轮回亲本合理地相似的植物时为止。在需要时使此植物自花授粉，随后再次筛选后代，以证实所述植物含有突变并展现出变体基因表达。可采用标准方法产生选择植物的原原种(breeder'sseed)，所述标准方法包括，例如田间试验、无效状态的证实、和/或对叶(例如，调制叶)进行化学分析用来确定生物碱水平。[0082]采用本文中描述的突变体烟草植物的植物育种计划的结果是新的且有用的栽培种、品种、品系、和杂种。如本文中使用的，术语"品种"是指植物的群体，这些植物有共同的恒定特征，使它们与同一物种的其他植物区分开来。品种常常以商品形式销售，尽管不总是如此。品种具有一种或多种独特性状，但品种的另一特征是个体之间有非常小的总体变异。通过若干世代的自花授粉和选择、或利用组织或细胞培养技术从单亲本进行营养繁殖，可以建立"纯系"品种。与品种不同，"品系"最常表示一组以非商业方式，例如在植物研究中应用的植物。品系就感兴趣的一个或多个性状而言在个体之间显示出很小的变异，不过就其他性状而言在个体之间可能存在一定变异。[0083]一个品种可实质衍生自另一个品系或品种。正如国际植物新品种保护公约（1961年12月2日，在1972年11月10日、1978年10月23日、和1991年3月19日在日内瓦修订)定义，种"实质衍生"自初始品种，条件是:a)它主要是衍生自初始品种、或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留表达由初始品种的基因型或基因型组合导致的关键特性;b)它与初始品种明显可区分;并且c)除衍生行为导致的差异外，在由初始品种的基因型或基因型组合导致的关键特性的表达上与初始品种相同。例如，实质衍生的品种可以通过天然或诱导的突变体、体细胞克隆变体、来自原始品种的变体个体植物的选择、回交、或转化而获得。[0084]可以通过阻止第一品种的母本植物（即，种子亲本）自花授粉、容许来自第二品种的父本植物的花粉对母本植物授精、并允许?:杂交种子在雌性植物上形成，来产生烟草杂种。可以通过在花发育早期使花去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可以采用某种形式的雄性不育来阻止母本植物上的花粉形成。例如，可以通过细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育、遗传雄性不育、分子雄性不育（其中转基因抑制了小孢子发生和/或花粉形成）、或自身不相容性来产生雄性不育。含有CMS的母本植物特别有用。在母本植物是CMS的实施方案中，父本植物一般含有育性恢复基因以确保F:杂种是可育的。在母本是CMS的其他实施方案中，可使用不含育性恢复基因的父本。由这种亲本产生的Fi杂种是雄性不育的。雄性不育杂种的种子可与雄性可育的种子间种以在所得雄性不育植物上提供结实用的花粉。[0085]本文所述的品种、品系和栽培种可用于形成单交烟草?:杂种。在这样的实施方案中，可将亲本品种的植株培养成基本上均一的邻接群体，以便于父本植物天然异花授粉至母本植物。通过常规手段选择性地收获母本植物上形成的F2种子。也可以大批量培养两个亲本植物品种，并收获母本上形成的^杂种种子和因自花授粉而在父本上形成的种子的混合物。或者，可进行三元杂交，其中将单交h杂种用作母本，并与另一不同的父本杂交。又或者，可产生双杂交种，其中两个不同单交的？:后代自身进行杂交。当形成双杂交种时，自身不相容性对于防止母本的自花授粉可能特别有用。[0086]在本文中描述的方法中使用的烟草植物可以是白肋烟型、深色型、烤烟型、马里兰型、或东方型。在本文中描述的方法中使用的烟草植物一般来自普通烟草，并且可来自多个普通烟草品种。品种可以是BU64、CC101、CC200、CC13、CC27、CC33、CC35、CC37、CC65、CC67、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、CC1063、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CU263、DF911、Galpao烟草、GL26H、GL338、GL350、GL395、GL600、GL737、GL939、GL973、GF157、GF318、RJR901、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925、PVH1118、PVH1452、PVH2110、PVH2254、PVH2275、VA116、VA119、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、LittleCrittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、NarrowLeafMadole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NCBH129、NC2002、NealSmithMadole、0XF0RD207、'Perique'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-ll、R7-12、RG17、RG81、RGH51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、SpeightG_28、SpeightG_70、SpeightH_6、SpeightH20、SpeightNF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LC、TND94、TND950、TR(TomRosson)Madole、VA309、或VA359〇[0087]除了突变之外，另一种可降低烟叶中生物碱量的方式是使用抑制性RNA(例如，RNAi)。因此，提供了含有编码至少一个RNAi分子的转基因的转基因烟草植物，所述RNAi分子在表达时使本文中描述的内源核酸(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)中的至少之一沉默。如本文中描述的，来自这种转基因植物的叶展现出至少一种生物碱量的降低(例如，与来自缺乏或不表达RNAi的植物的叶相比）。另外，来自这种转基因植物的叶展现出至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)量的降低(例如，与来自缺乏或不表达RNAi的植物的叶相比）。[0088]RNAi技术是本领域已知的，是转录后基因沉默的非常有效的形式。RNAi分子一般含有长度约18个核苷酸(例如，长度约19或20个核苷酸），乃至长度约700个核苷酸的核苷酸序列，在有义和反义方向均与靶基因互补。有义和反义链可通过短"环"序列(例如，长度约5个核苷酸到长度约800个核苷酸)连接，并表达为单个转录本，或者有义和反义链可在不同的载体或构建体上递送到靶细胞中并在其中的表达。许多公司提供RNAi设计与合成服务(例如，LifeTechnologies，AppliedBiosystems)，针对本文中描述的若干新序列的代表性RNAi分子提供在SEQIDN0:51-56中。[0089]可利用植物表达载体来表达RNAi分子。RNAi分子一般在长度上为至少25个核苷酸并与本文中公开的核酸序列（例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)之一具有至少91%序列同一性(例如，至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性），或者在严格条件下与本文中公开的核酸序列(例如，SEQIDΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)之一杂交。在严格条件下的杂交如上文所述。[0090]将核酸(例如，异源核酸）导入植物细胞中的方法是本领域已知的，并且包括例如粒子轰击、土壤杆菌介导的转化、显微注射、聚乙二醇介导的转化(例如，原生质体转化，参见，例如，Yoo等人(2007，Nature?仰切(3〇18,2(7):1565-72))、脂质体介导的0嫩摄取、或电穿孔。转化之后，转基因植物细胞可被再生为转基因烟草植物。如本文中描述的，转基因的表达导致叶中展现出至少一种生物碱的量减少，和/或所得的调制叶中至少一种TSNA的量降低，相对于来自不表达转基因的植物的叶。可以对再生的转基因植物的叶筛选调制叶中一种或多种生物碱和/或一种或多种TSNA的量，并且可以选择与相应的非转基因植物相比在所得调制叶中具有降低量的至少一种生物碱和/或至少一种TSNA的植物，以供在例如本文论述的育种计划中使用。[0091]赋予诸如除草剂抗性(有时被称为除草剂耐受性）、抗虫性、或胁迫耐受性之类的性状的核酸也可存在于本文描述的新的烟草植物中。赋予针对抑制生长点或分生组织的除草剂(例如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性的基因可能是适合的。这个类别中的示例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，如在例如美国专利Nos.5，767，366和5，928，937中描述的。美国专利Nos.4，761，373和5，013，659涉及抵抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物。美国专利No.4,975,374涉及含有编码抵抗除草剂的抑制作用的突变体谷氨酰胺合成酶(GS)的基因的植物细胞和植物，已知这些除草剂(例如膦丝菌素和甲硫氨酸亚砜亚胺)抑制GS。美国专利No.5，162,602公开了抵抗环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用的植物。[0092]抗草甘膦的基因也是适合的。参见，例如，美国专利Nos.4，940，835和4，769，061。这样的基因可赋予对草甘膦除草剂组合物的抗性，所述组合物包含但不限于草甘膦盐类，如三甲基硫盐、异丙胺盐、钠盐、钾盐和铵盐。参见，例如，美国专利如8.6,451，735和6,451，732。抵抗磷酰基化合物(例如草铵膦或膦丝菌素、以及吡啶氧基丙酸或苯氧基丙酸和环己酮）的基因也是适合的。参见，例如，美国专利如8.5,879,903;5,276,268;和5,561，236;以及欧洲申请No.0242246。[0093]其他适合的除草剂包括抑制光合作用的那些，例如三嗪和苯基氰(腈水解酶）。参见美国专利No.4，810，648。其他适合的除草剂包括2，2-二氯丙酸、稀禾定、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈。其他适合者为对原卟啉原氧化酶(protox)酶赋予抗性的除草剂。参见，例如，美国专利No.6，084，155和US20010016956。[0094]可得到对例如鳞翅目昆虫之类的昆虫赋予抗性的多种基因。示例性基因包括编码截短的CrylA(b)和CrylA(c)毒素的那些基因。参见，例如，描述于美国专利Nos.5,545,565;6,166,302以及5,164,180中的基因。参见例如，Vaeck等人，1997，Nature,328:33-37和Fischhoff等人，1987，NatureBiotechnology，5:807-813。特别有用的是编码展现出针对烟草天蛾（tobaccohornworm);烟芽夜蛾（烟草姐虫）和/或烟草斜纹夜蛾（tobaccocutworm)的杀虫活性的毒素的基因。[0095]具有增加的叶生物碱量的植物及制造方法[0096]可以在植物中过表达本文中描述的序列以增加叶中一种或多种生物碱(和/或一种或多种TSNA)的量。因此，提供了转基因烟草植物、或来自这种植物的叶，所述植物经过本文中描述的在能驱动植物中表达的启动子(例如，植物启动子）的控制之下的核酸分子(例如，SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)或其功能片段的转化。如本文中论述的，在植物表达载体中的核酸分子可具有与本文中描述的序列不同的序列，其不同可表示为序列同一性百分比（例如，相对于SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90)或基于所述序列与SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、或90杂交的条件。[0097]作为利用全长序列的替代方案，可以采用编码具有期望功能性的多肽片段(在本文中称为"功能片段"）的序列的一部分。当采用核酸时，应当理解的是，具有功能性的并不是核酸片段，而是被编码的多肽片段。基于本文中的发明公开在以及在图1、2、3和4中所示的比对，本领域技术人员可以预测能够赋予期望的功能性的多肽的部分(例如，一个或多个结构域)。[0098]在转化之后，转基因烟草细胞可被再生为转基因烟草植物。可以对再生的烟草植物的叶筛选一种或多种生物碱的量，并且可以选择与相应的非转基因植物中的量相比至少一种生物碱的量有所增加的植物，以供在例如本文论述的育种计划中使用。，核酸分子或其功能片段的表达可导致叶展现出至少一种生物碱的量相比来自不表达所述核酸分子或其功能片段的烟草植物的叶有所增加。还可将赋予除草剂抗性、抗虫性、或胁迫耐受性的核酸导入这样的烟草植物中。_9]烟草产品和制造方法[0100]本文中描述的方法允许改变烟草植物中的叶成分。如本文中描述的，改变叶成分是指降低或增加叶中至少一种生物碱的量。如本文中描述的，这样的方法可包括诱变(例如，随机或靶向的)或产生转基因植物(例如，利用RNAi或过表达）。[0101]来自这样的烟草的叶（例如，具有一种或多种生物碱量的降低或增加)可以调制、陈化、回潮和/或发酵。调制烟草的方法是熟知的，包括例如晾制、熏制、调制和晒制。陈化也是已知的，并且一般在木桶（例如，大桶)或硬纸盒中在约10%到约25%的含湿量在压实条件下进行几年(例如，2到5年）（参见，例如，美国专利如.4,516,590和5,372，149)。回潮例如包括如US2004/0118422或US2005/0178398中描述的加热、蒸发水分或巴氏消毒步骤，而发酵的典型特征为高初始含湿量、产热、和10%到20%的干重损失。参见，例如，美国专利Nos.4,528，993、4,660，577、4,848,373和5,372,149。在需要时，烟草还可以进一步加工（例如，切割、膨胀、混合、研磨或粉碎），并用于烟草产品中。[0102]烟草产品是本领域已知的，并且包括任何从烟草制成或衍生的旨在用于人类消费的产品，包括烟草产品的任何组分、部分、或辅助用品。代表性烟草产品包括但不限于，无烟烟草产品、烟草衍生的烟碱产品、小雪前、无通气凹槽(non-ventilatedrecess)过滤嘴香烟、通气凹槽(ventedrecess)过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、香烟烟草、咀嚼烟草、烟叶、烟丝、和切碎烟草。代表性无烟烟草产品包括，例如，咀嚼烟草、湿鼻烟(snus)、烟袋(pouch)、烟膜(film)、烟片（tablet)、涂层烟钉(coateddowel)、烟杆(rod)，等等。代表性香烟和其他烟制品包括，例如，包括滤芯或杆元件在内的烟制品，其中可以点燃抽吸的材料杆元件可包括在烟草混合物之内的调制烟草。除了本文中描述的生物碱降低的烟草之外，烟草产品还可包含其他成分，例如但不限于，粘合剂、增塑剂、稳定剂、和/或调味剂。参见，例如，US2005/0244521、US2006/0191548、US2012/0024301、US2012/0031414、和US2012/0031416,为烟草产品的实例。[0103]将在下列实施例中进一步描述本发明，这些实施例并不限制权利要求书中记载的主题方法和组合物的范围。实施例[0104]实施例1一生物碱从根到叶的转运[0105]以前的研究已显示，花烟草，普通烟草的一种亲缘植物，不转运生物碱到叶(Pakdeechanuan等人，2012，PlantCellPhysiol·，53(7):1247-54)。这种表型的证实如图5中所示。还测试了花烟草在打顶(topping)之后能够转运生物碱的可能性。参见表1。所有测试情形下均未发现生物碱转运到叶。[0106]表1.打顶和未打顶的花烟草的叶和根的生物碱含量[0107][0108]L0Q，定量限;ND，未检测到[0109]实施例2-RNA制备和测序[0110]在打顶之前和之后从花烟草植物的根组织采集RNA，利用来自Illumina的True-SeqLibraryConstructionKit建立RNA测序文库。利用IlluminaMiSeq平台完成花烟草RNA的测序。测序进程以150个周期的双端读段参数进行，并使用E-基因毛细管电泳仪确定文库质量和平均大小。通过ArrayXpress(Raleigh，NC)进行的RNA深度测序，确定TN90烟草中的根特异性基因表达。[0111]在测序之后，修整所得序列，并将品质得分高于30的读段装配为重叠群。然后将单独的序列读段回贴(map)到这些重叠群上。测序进程1生成了针对总共69Mb序列数据的460万个回贴读段，测序进程2生成了针对总共37.5Mb序列数据的250万个回贴读段。这产生了106.5Mb序列读段，供花烟草基因表达分析中使用。[0112]通过与具有95%序列同一性截止值的本塞姆氏烟草参考基因组相比较，确定全长编码序列。全长编码序列和由此编码的预测多肽显示在SEQIDN0:1-50和70-91中。[0113]实施例3-表达水平的分析[0114]分析TN90和花烟草基因表达数据，以鉴定相比于普通烟草在花烟草中差异表达或未检出的转运相关基因。基于与其他组织的表达差异，针对根特异性表达将TN90表达数据过滤（>9倍以上的基因表达，p值〈0.000001)。然后针对高的根表达(在打顶之后>100个读段)将结果过滤。然后针对基因本体论(G0)术语将基因过滤，所述术语表示次级代谢物的转运蛋白（例如，术语"转运"结合"药物"或"噪呤"用于过滤结果）。利用相同的G0标准，将两个独立的测序轮次中在花烟草中未检出的基因过滤。然后比较这些数据集，以确定落入所有三个类别的基因（即，（i)高的根特异性表达、（ii)G0标准、和(iii)在花烟草中不表达）。[0115]在表2中列出这些基因、以及它们在TN90烟草中的表达水平。[0116]表2.在TN90中的基因表达[0118]*，打顶之后的小时数;ND=未检出[0119]还分析了花烟草基因相对于TN90表达的表达水平，以确定可能在花烟草中高表达、而不在普通烟草中高表达的调苄基因和/或生物合成基因。鉴定了四个靶标，在表3中列出。[0120]表3.在花烟草中高表达的基因的表达[0121][0122][0123]a，在打顶之后72小时采集的根组织;*，打顶之后的小时数[0124]实施例4一序列比对[0125]预期涉及转运的基因落入五个主要类别:烟碱摄取通透酶(Nup)家族、多药和毒性化合物外排型(MATE)家族、多药耐药(MDR)家族、和多向耐药(PDR)家族、以及一组无关基因。将核苷酸序列和预测的多肽序列与保藏在公共数据库中的序列进行比较。这些比较的结果显示在表4(Nup序列）、表5(MDR序列）、表6(MATE序列）、表7(PDR序列）、表8(其他转运蛋白序列）、和表9(以高水平表达的花烟草基因）中。[0126]表4.Nup序列[0127][0128]表5.MDR序列[0131]表6.MATE序列[0133]表7.TOR序列[0134][0135]表8.其他转运蛋白序列[0136][0137]表9.以高水平在花烟草中表达的基因[0138][0139]在花烟草中相对于普通烟草高表达的基因之一，C33728,似乎是富含AC的结合因子(ACBF)调节蛋白。这种多肽当被转移到烟草时，显示出与来自豆类的异源性木质部相关启动子的启动子中富含AC的重复区域结合，而且发现所述多肽在所有组织中表达，但最普遍地在植物的茎中表达(S6guin等人，1997，PlantMol.Biol.，35(3):281-91)。该多肽含有三个不同的预测的RNA结合结构域，以及一个可能涉及基因活化的富谷氨酰胺区域。这些预测的结构域在下文的SEQIDN0:50中以下划线表示。N端结构域富含谷氨酰胺。这种类型的结构域架构可见于许多剪接因子中（Lorkovic和Barta，2002，Nuc.AcidsRes.，30:623-35)〇[0141]实例5-RNAi品系开发、质粒构建和转化[0142]为了评估候选基因的功能，产生了两组转基因植物，一组利用全长编码序列，一组利用RNAi序列（参见图6)。为了表达全长编码序列或RNAi序列，使用了一种表达载体（SEQIDN0:21)，其具有CsVMV启动子和N0S终止子、以及一个带有肌动蛋白2启动子指导下的卡那霉素选择标志物(NPTII)并具备N0S终止子的盒。利用DNA轰击或基因枪法，将携带感兴趣转基因的核酸构建体导入烟草叶盘中。参见，例如，Sanford等人，1993,MethodsEnzymol·，217:483-510;以及Okuzaki和Tabei，2012，PlantBiotechnology，29:307-310。[0143]简言之，如下所述将含有转化盒的质粒DNA包被在Ιμπι的金颗粒上(DNA/金）dym的金颗粒在180°C烘烤12小时，并制备储液(40mg/ml)。为了制备用于10次射弹的混合物，在1·5ml的管中将100μ1的储液与40μ1的表达载体DNA(lygAU)、100μ1的2·5MCaCl2、和40μ1的0.1Μ亚精胺混合。将混合物在13，000Xg下离心30秒，并用500μ1100%乙醇洗涤沉淀。DNA/金混合物悬浮在100μ1的水中，加10μ1到载体膜(macrocarrier)上，干燥，然后进行轰击。在]^S-lOOO/He系统（Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)中，米用1，100psi破裂盘在部分真空下(71ImmHg)对每个平板进行两次射弹轰击。[0144]NarrowLeafMadole(NLM)和Tennessee90(TN90)烟草叶盘以RNAi构建体进行转化，而花烟草的烟草叶盘以全长候选基因构建体进行转化。将完整烟叶（约45X30mm长)置于MS培养基上过夜，在第二天用所述构建体对叶盘进行轰击。然后将叶子切成小片（约5X5mm)，置于Τ0Μ培养基(含20g蔗糖/L;lmg/LIAA和2.5mg/LBAP的MS培养基）上在27°C培育3-5天，然后转移到含300mg/l卡那霉素的Τ0Μ培养基(TOM-Kan)上培育。每2-3周将组织转移至噺的TOM-Kan平板上，持续4-6周（27°C，16h光照）。在轰击4-6周之后再生抗卡那霉素的初生芽。将芽转移到MS卡那霉素平板上以生根。[0145]评估来自T1植物(及后续世代）的叶和/或根，以确定一种或多种生物碱和/或一种或多种TSNA的量。[0146]实施例6-RNAi分子的序列和表达构建体[0147]RNAi分子序列在下文示出。加双下划线部分是环，其来自烟草QS基因序列。[0163]表达盒的序列显示在下文，其中有关部分指示在左边缘。还参见图6。[0164]转化盒序列（SEQIDN0:57):[0166]实施例7-随机诱变和突变体的表征[0167]对于EMS突变，将一克(大约10,000粒种子)Tennessee90烟草(TN90)转化种子在0.1%吐温:?中洗涤十五分钟，然后在30ml的ddH2〇中浸泡两小时。然后将一百五十（150)μ1的0.5%EMS(Sigma，目录号Μ-0880)混合到种子/ddH2〇溶液中，在罩子下在室温(RT;大约20°C)温育8-12小时（在30rpm旋转）。然后从种子去除液体，并将液体混合到1MNaOH中过夜，以去污和处置。然后用l〇〇mlddH20洗涤种子两次，每次2-4小时。然后将洗涤的种子悬浮在0.1%琼脂:水溶液中。[0168]将琼脂溶液中的EMS处理过的种子以约2000粒种子/浅箱均匀撒布在装有浸水的Carolina'sChoiceTobaccoMix?(CarolinaSoilCompany，Kinston，NC)浅箱上。然后用塑料包装覆盖这些浅箱，置于生长室中。一旦苗从土壤中萌出，即刺穿塑料包装，以便让湿度逐渐下降。两周之后完全移除塑料包装。将浅箱移动到温室，用NPK肥料进行施肥。将苗插入浮盘中，培育至移植大小。将植物移植到田间。在生长期间，植物进行自花授粉，形成施种子。在成熟期，从每株植物收获五个荚，对来自每株植物的种子集合给予单独命名。这形成Μι种群。[0169]种植每株Mo植物的％种子的混合物，从％植物采集叶子并提取DNA。扩增靶基因并测序，以便进行突变鉴定。[0170]实施例8-使用TALEN的靶向诱变[0171]在特异性基因靶内或在启动子序列内发现了基因特异性TALEN识别序列，可用于靶向缺失或启动子插入以便降低基因表达或改变组织特异性表达。感兴趣区域的序列显示在下文（SEQIDN0:61-69)。在感兴趣区域的相应序列中，基因C22474(Pdr5b)的特异性靶序列以下划线表示。感兴趣的所有TALEN区域的位置示意性地显示在图7中。黄色条表示包含内含子的初级转录物。绿色表示标记为启动子区域的上游区域。基于已知的基因组序列信息，这些TALEN位点对于单基因靶是特异的。每个基因的TALEN区域1和2用来破坏启动子或编码区的5'端，而其他区域只用来破坏编码序列。[0190]将感兴趣基因的革巴序列送到LifeTechnology(Carlsbad，CA)，以确定转录激活因子样(TAL)效应蛋白的可能结合位点序列。由LifeTechnology合成TAL并克隆到发明人的植物表达载体PALCS1中，用作入门载体。根据用途，可以采用五种不同的方案来产生诱变的烟草品系：1)将一个或多个入门载体(含有靶TAL的pALCSl)直接转化到烟草原生质体中，以产生随机序列缺失或插入诱变烟草品系;2)将左右两侧由与靶插入序列同源的序列包夹的供体序列(例如，报告基因，例如，GUS基因）连同一个或多个入门载体(含靶TAL的pALCS1)共转化到烟草原生质体中，以产生含报告基因的诱变烟草品系;3)将包含具有点突变的靶TAL的供体序列连同一个或多个入门载体(含靶TAL的pALCSl)共转化到烟草原生质体中，以产生具有点突变的诱变烟草品系;4)含组织特异性启动子序列的供体序列，其产生以组织特异性方式表达内源基因的突变体烟草品系;和5)含有上述供体序列与报告基因构建体的组合的供体序列，其促进突变体烟草的筛选。[0191]从生长室中Magenta盒内培植的TN90烟草的叶分离烟草原生质体。将来自3-4周大的植物的充分展开的叶（5cm)从叶中部切割成0.5到1mm的叶条。将叶条转移到制备的酶溶液（1%纤维素酶R10、0.25%离析酶RHK0.4M甘露醇、20mMKCl、20mMMES(pH5.7)、10mMCaCl2、0.1%BSA)中，将叶条的两个侧面浸入。使用干燥器在黑暗中将叶条进行真空浸润30分钟，在没有搅拌的条件下，在黑暗中在室温继续消化4小时到整夜。原生质体在100μπι尼龙过滤器中过滤，用3mlLymphoprep进行纯化。用W5n溶液（154mMNaCl、125mMCaCl2、5mM1((：1、211^1^3、99111^/1葡萄糖，？!15.7)将原生质体离心和洗涤，并以51105/1111的浓度悬浮在W5n溶液中。将原生质体在冰上保持30分钟，以便重力沉降到管的底部。移去W5n溶液，在室温下使原生质体重悬在P2溶液中。在15ml微量离心管中轻轻混合50μ1DNA(10-20yg的质粒）、500μ1原生质体(2xl05个原生质体)和550μ1的PEG溶液(40%，v/v10ml4gPEG4000、0.2M甘露醇、0.1MCaCl2)，在室温下温育混合物5分钟。[0192]离心沉淀原生质体并将其重悬在lml2X8EN1(8EN1:没有NH4N03的MS盐、MS维生素、0.2%肌醇、4mMMES、lmg/lNAA、lmg/lΙΑΑ、0·5Μ甘露醇、0.5mg/lΒΑΡ、1·5%蔗糖）中。用等量的低熔点琼脂(LMA)使转化的原生质体成凝胶状，0.2ml的原生质体LAM滴落形成珠子。珠子中加入10ml8ENl，7天后，取出5ml8EN1并添加5ml8EN2(具有0.25M甘露醇的8EN1);又过7天之后（第14天），取出10ml8EN2并添加10ml8EN2;再过7天（第21天），取出5ml8EN2并添加5ml8EN3(具有3%蔗糖而没有甘露醇的8EN1);再过7天（第28天），取出10ml8EN3并添加10ml8EN3。将原生质体保持两周，直到微愈伤组织生长时为止。愈伤组织转移到NCM固体培养基上，直到达到约5mm时为止(通常约两周）。愈伤组织转移到TOM-Kan固体培养基上生根，并采用本文中描述的方法使转化的烟草植物再生。[0193]表10.TAL效应子结合位点序列[0194][0?95]加下划线=TAL结合位点；TAL结合位点之间的非加下划线区域=设计发生DNA切割的位置[0196]实施例9一筛选植物的生物碱含量调节[0197]在田间类似条件下的温室中，在装有Carolina'sChoiceTobaccoMix(CarolinaSoilCo.，Kinston，NC)10英寸盆中培育实施例5、6、7或8中鉴定的转基因和突变体烟草植物。在开花期，将植物打顶，并在2周之后从打开的叶和根采集组织样品。[0198]利用研钵及研件研磨组织。使用来自AristaLaboratories的认证方案，通过气相色谱和质谱联用确定生物碱含量。确定烟碱、降烟碱、新烟碱及新烟草碱的量以及总生物碱的含量。[0199]实施例10-烟碱补加测定[0200]通过与肥水一道补加烟碱来提高烟碱的量，可以测试转基因幼苗中的烟碱转运，而且与等候内源生物碱达到可测相比，表型确定可以大大提早。通过两种独立的方法进行补加测定。在第一种方法中，幼苗转移到Styrofoam浮盘中。让这些植物在lOOpprn肥水(Pete'sProfessional)中生长，直到根开始从盘底出现时为止。然后使盘漂浮在加肥料的烟碱溶液（1禮烟碱、lOOpprn肥料）中，持续三天。收获根和叶组织，并如上所述提取和分析生物碱。计算根和叶的烟碱含量以及叶与根烟碱水平的比值（图8)。在第二种方法中，将植物转移到4英寸盆。在根生长至足以将土壤保持在一起之后，转移到去底的4英寸盆中。生长2周之后，用加肥料的烟碱溶液处理植物，每天两次，持续2天。在补加烟碱之前和之后收获叶子，并如前所述提取和分析生物碱。在补加之前和之后的叶烟碱含量显示在图9中。[0201]在表达靶向roR家族基因C22474的RNAi构建体(PALCS-TDNA-R1)的两种植物中发现烟碱水平降低:靶向MDR家族基因11099的RNAi构建体(pALCS-TDNA-R2)的一种植物显示出在饲喂之后的烟碱水平降低；并且靶向未分类基因C43677的RNAi构建体(pALCS-TDNA-R4)的一种植物也显示出叶中烟碱水平的降低。RNAi靶向位点的位置显示在图7中。[0202]实施例11一普通烟草与耳状烟草的比较[0203]普通烟草来源于两个不同的烟草属谱系的杂交。花烟草代表不转运生物碱的林烟草谱系成员（参见以上实施例3)。耳状烟草为其他谱系（绒毛状烟草）的非转运成员。进行RNA测序来确定在耳状烟草中缺失但在普通烟草中以高水平存在的转运相关基因。[0204]简言之，打顶10天之后，从耳状烟草和普通烟草TN90的根样品采集根样品。由AmbryGenetics(Aliso￥丨6]_〇,04)提取1?嫩并完成测序。1?熟测序产生了1.25亿个序列读段。生成耳状烟草的从头重叠群序列，并且使用以前从TN90获得的基因组序列供比较。将序列读段回贴到耳状烟草的从头重叠群序列，然后将剩余的未回贴读段回贴到TN90基因组，得到一系列预期将不存在于耳状烟草中的基因。基于基因本体论术语，选择与次级代谢物转运有关的基因。这些基因在各个时间点的表达水平显示在表11中。[0205]表11.在TN90中的基因表达[0207]*，打顶之后的小时数;ND=未检测到[0208]将核苷酸序列和预测的多肽序列与保藏在公共数据库中的序列进行比较。这些比较的结果在表12中示出。[0209]表12.序列比对[0210][0211][0212]应当理解的是，虽然在本文中结合许多不同的方面描述了主题方法和组合物，但前述各个方面的说明旨在展示而不是限制主题方法和组合物的范围。其他方面、优点、以及修改落在以下的权利要求书的范围之内。【主权项】1.一种烟草杂种、品种、品系、或栽培种，其包括在一个或多个内源核酸中具有突变的植物，所述内源核酸具有选自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。2.权利要求1的烟草杂种、品种、品系、或栽培种，其中来自所述植物的叶相对于来自缺少所述突变的植物的叶展现出至少一种生物碱的量降低。3.权利要求2的烟草杂种、品种、品系、或栽培种，其中来自所述植物的调制叶相对于来自缺少所述突变的植物的调制叶展现出至少一种烟草特异性亚硝胺(TSNA)的量降低。4.由权利要求1-3中任一项的烟草杂种、品种、品系、或栽培种产生的种子，所述种子在一个或多个内源核酸中包含突变，所述内源核酸具有选自SEQIDΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。5.-种制造烟草植物的方法，包括下列步骤：在普通烟草(Nicotianatabacum)细胞中诱导诱变以产生诱变细胞；获得来自诱变细胞的一株或多株植物;和鉴定其中至少一株在一个或多个内源核酸中包含突变的植物，所述内源核酸具有选自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。6.权利要求5的方法，进一步包括鉴定其中至少一株包含这样的叶的植物:所述叶相对于来自缺乏突变的植物的叶展现出至少一种生物碱量降低。7.权利要求6的方法，进一步包括鉴定其中至少一株包含这样的叶的植物:所述叶在调制后，相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种TSNA量降低。8.权利要求5的方法，其中诱变是使用化学诱变剂或电离辐射诱导的。9.权利要求8的方法，其中化学诱变剂选自亚硝酸、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙锭、和甲磺酸乙酯(EMS)。10.权利要求8的方法，其中电离辐射选自X射线、γ射线、快中子照射、和UV照射。11.权利要求5的方法，其中诱变是使用TALEN诱导的。12.权利要求5的方法，其中诱变是使用锌指技术诱导的。13.-种产生烟草植物的方法，所述方法包括下列步骤：使第一烟草品系的至少一株植物与第二烟草品系的至少一株植物杂交，所述第一烟草品系的植物在一个或多个内源核酸中具有突变，所述内源核酸具有选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列；和选择具有所述突变的后代烟草植物。14.权利要求13的方法，进一步包括选择包含这样的叶的后代烟草植物:所述叶相对于来自缺乏突变的植物的叶展现出至少一种生物碱量降低。15.权利要求14的方法，进一步包括选择包含这样的叶的后代烟草植物:所述叶在调制后，相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种TSNA量降低。16.-种包含来自烟草植物的调制叶的烟草产品，所述所述烟草植物在一个或多个内源核酸中具有突变，所述内源核酸具有选自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列。17.权利要求16的烟草产品，其中所述叶相对于来自缺乏突变的植物的叶展现出至少一种生物碱的量降低。18.权利要求17的烟草产品，其中所述调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种TSNA的量降低。19.一种产生烟草产品的方法，该方法包括：提供来自在一个或多个内源核酸中具有突变的烟草植物的调制叶，所述内源核酸具有选自SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90的序列；和利用所述调制叶制造烟草产品。20.权利要求19的方法，其中所述调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种生物碱的量降低。21.权利要求19的方法，其中所述调制叶相对于来自缺乏突变的植物的调制叶展现出至少一种TSNA的量降低。22.权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述突变选自点突变、插入、缺失、和取代。23.-种筛选植物的方法，其包括：提供来自权利要求1-3中任一项的植物的植物材料;和确定植物组织中一种或多种生物碱的量。24.权利要求23的方法，其中所述植物组织是叶。25.权利要求23的方法，其中所述植物组织是根。【文档编号】A24B13/00GK105960460SQ201480075000【公开日】2016年9月21日【申请日】2014年12月8日【发明人】J·弗雷德里克,Y·沈,D·许,U·瓦雷克,J·A·斯特里克兰【申请人】奥驰亚客户服务公司