胞、巨噬细胞特异性蛋白的表达来评价利用本实用新型的微流控芯片构建的模拟肿瘤细胞转移微环境的仿生模型的有效性。
[0033]5、进行肿瘤细胞转移过程的检测
[0034]通过检测肿瘤细胞发生上皮-间质转化(EMT)标记蛋白表达评价转移性肿瘤细胞的生成；通过细胞形态的观察比较转移性肿瘤细胞生长模式；通过肿瘤细胞发生间质-上皮转化(MET)标记蛋白表达评价转移性肿瘤细胞迀移到靶器官之后的变化；通过检测靶器官损坏标记蛋白的表达来评价转移性肿瘤细胞是否已侵袭到靶器官中。
[0035]在本实用新型的具体实施方案中，上皮细胞为支气管上皮细胞；肿瘤细胞为肺癌细胞，即使用本实用新型的微流控芯片构建了一个模拟肺癌细胞转移微环境的仿生模型。
[0036]原理:本实用新型采用PDMS和带有网孔的渗透膜材料，依据体内细胞与细胞、细胞与培养介质、组织与组织间、器官与微环境间相互作用的特性以及流体力学原理，设计和制作一个能够接近肺解剖结构、模拟肺生理功能的多单元集成、多通道连接的高通量微流控芯片实验室。该实验室设计的核心问题是如何重建肺的解剖结构，包括各级支气管、肺泡在内的肺实质和肺间质以及如何模拟肺的主要生理功能，即气体交换。以一层带有网孔的渗透膜替代呼吸运动时可促使扩张的肺泡回缩的弹性纤维，通过在膜上下两面分别支气管上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞的二维培养，模拟肺实质和间质，并构成了气血屏障，继而在与膜平行方向分别通入气体和液体供应氧分与营养物质，在与膜垂直方向的两侧连接两个真空通道，模拟人体呼吸节律。当真空通道泵入气体时，渗透膜回缩，气体通道氧气泵入，肺泡扩张，模拟肺脏吸气功能；当真空通道回抽气体时，渗透膜拉伸，气体通道氧气泵出，肺泡收缩，模拟肺脏呼气功能。至此，构建了一个接近肺解剖结构、能够模拟肺主要生理功能的仿生肺芯片生理模型。在上述仿生芯片肺生理模型基础上，依据绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，将肺癌分别接种于支气管上皮细胞区，构建仿生芯片肺癌病理模型；依据肺癌转移途径及好发部位，在上述肺癌病理模型上搭建神经胶质细胞培养室、骨细胞培养室、及肝细胞培养室分别模拟脑、骨、肝等肺癌最常转移的靶器官，构建肺癌不同转移阶段病理模型，再现肺癌侵袭转移全过程。
[0037]本实用新型的优点和有益效果为:
[0038](I)本实用新型的微流控芯片可以实现细胞的三维培养，来更好的完成体内生物学功能研宄；该微流控芯片用于检测的试剂消耗量显著低于传统平台。
[0039](2)细胞在本实用新型的微流控芯片平台中培养具有良好的适应性；微流控芯片的主要材料是PDMS，PDMS具有良好的生物相容性和高度的透气性，气体可以顺畅通过PDMS，从而保证了芯片内培养的细胞与外媒的气体交换。
[0040](4)传统平台上细胞生长的静态宏观环境与体内细胞生存微小立体空间相差悬殊，微流控芯片体系则弥补了传统平台在这方面的缺陷，它具有更好的密闭性，因此细胞生存空间的大小与人体内细胞生存的生理微空间更加相似，这种微小空间内的原位在线检测也进一步增加了检测结果的可信度。
[0041](5)本实用新型的微流控芯片平台操作简便，省时省力。
【附图说明】
[0042]图1显示本实用新型的微流控芯片结构的分解图；
[0043]图2显示本实用新型的微流控芯片结构的分解图；
[0044]图3显示本实用新型的微流控芯片整体结构的俯视图；
[0045]图4显示本实用新型的微流控芯片的第一层基片结构的侧视图；
[0046]图5显示本实用新型的微流控芯片的第二层基片结构的侧视图；
[0047]图6显示本实用新型的微流控芯片的第三层基片结构的侧视图；
[0048]图7显示本实用新型的微流控芯片的多孔PDMS膜的侧视图；
[0049]图8显示利用H33342/PI染色检测芯片中细胞活力，其中，A:16HBE细胞24H后的细胞形态:HUVEC细胞24H后的细胞形态；C:16HBE细胞48H后的细胞形态；D:HUVEC细胞48H后的细胞形态；E:16HBE细胞H33342/PI染色；F:HUVEC细胞H33342/PI染色；
[0050]图9显示利用免疫染色检测支气管上皮细胞16HBE和血管内皮细胞HUVEC的连接情况，其中，G:16HBE细胞中E-cadherin蛋白免疫染色:HUVEC细胞中E-cadherin蛋白免疫染色；
[0051]图 10 显不利用 Immunofluorescence cell tracker express1n assay 检测肺癌细胞A549和支气管上皮细胞16HBE的共定位情况，其中，A:16HBE细胞形态；B:16HBE与A549共培养的细胞形态；C:16HBE细胞cell tracker染色；D:16HBE与A549共培养celltracker 染色；
[0052]图11显示利用免疫染色检测肺癌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞的特异性蛋白的表达情况，其中，E:16HBE细胞CEA蛋白免疫染色；F: 16HBE与A549共培养CEA蛋白免疫染色；G:成纤维细胞中a-SMA蛋白免疫染色；H:CAF(癌相关成纤维细胞)中a-SMA蛋白免疫染色；1:巨噬细胞中⑶206蛋白免疫染色J:CAM(癌相关巨噬细胞)中⑶206蛋白免疫染色；
[0053]图12显示利用免疫染色检测肺癌细胞中上皮细胞间质转化marker的表达情况，其中，A:细胞免疫染色图；B:光密度值统计图；
[0054]图13显示利用细胞计数检测肺癌细胞A549到远端组织的迀移情况；
[0055]图14显示利用显微镜观察肺癌细胞A549在远端组织处的生长模式；
[0056]图15显示利用免疫染色来检测远端组织中特征性蛋白的表达情况，其中，A:特征性蛋白免疫染色图:光密度值统计图；
[0057]其中，1:第一层PDMS基片；11:空气通道；12:第一层液体入口 ；13:第一层液体出口 ；14:第一真空通道；15:第二真空通道；2:第二层PDMS基片；21:液体通道；22:第二层液体入口 ；23:第二层液体出口 ；211:第一连接通道；212:第二连接通道；213:第三连接通道；214:第一入口 ；215:第二入口 ；216:第三入口 ；3:第三层PDMS基片；31:第一细胞培养室；32:第二细胞培养室33:第三细胞培养室；4:第一多孔PDMS膜；5:第二多孔PDMS膜。
【具体实施方式】
[0058]通过参阅下述实施例可以更容易地了解本实用新型的内容，这些实施例只是为进一步说明本实用新型，并不意味着限定本实用新型的范围。
[0059]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061]实施例1 一种用于监测肿瘤转移过程的微流控芯片
[0062]本实用新型的微流控芯片是由三层PDMS基片和两层多孔PDMS膜相互交错不可逆的封接而成的一个密闭整体；第一层PDMS基片I上设有供空气流通的空气通道11、供液体进出的第一层液体入口 12和第一层液体出口 13，分别位于空气通道11两侧的第一真空通道14的上半部分和第二真空通道15的上半部分；第二层PDMS基片2上设有供液体流通的液体通道21、供液体进出的第二层液体入口 22和第二层液体出口 23，分别位于液体通道21两侧的第一真空通道14的下半部分、第二真空通道15的下半部分，液体通道21的侧边上设有三条向外延伸的连接通道，分别为第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213，第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213的末端分别设有第一入口 214、第二入口 215、第三入口 216 ;第三层PDMS基片3上设有供细胞培养的第一细胞培养室31、第二细胞培养室32、第三细胞培养室33 ;第一细胞培养室31、第二细胞培养室32、第三细胞培养室33分别位于第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213的下方，通过第一多孔PDMS膜5与第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213相通；第一真空通道14的上半部分、第二真空通道15的上半部分和第一真空通道14的下半部分、第二真空通道15的下半部分结构相对应形成结构完整的第一真空通道14和第二真空通道15 ;第一层液体入口 12和第一层液体出口 13分别设置于空气通道11的上下游且同侧；第二层液体入口 22和第二层液体出口 23分别设置于液体通道21的上下游且同侧，空气通道11位于液体通道21的正上方，空气通道11的开口与液体通道21的开口相对且通过第二多孔PDMS膜4隔开；空气通道11覆盖在液体通道21的上游端，第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213位于液体通道21的下游端。
[0063]第一多孔PDMS膜4和第二多孔PDMS膜5的厚度为10 μ m、孔径为10 μ m。
[0064]空气通道11和液体通道21的横截面为长方形，尺寸为:高5mm、宽4mm ;通道14、15的横截面为长方形，尺寸为:高7mm、宽2mm ;第一细胞培养室31、第二细胞培养室32、第三细胞培养室33的横截面形状为长方形，尺寸为:高1.5mm、宽1.5mm。
[0065]空气通道11的长度为1mm ;液体通道21的长度为35mm ;第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213距离液体通道21的一端的距离是2.2mm。
[0066]第一层液体入口 12和第二层液体出口 13的距离是15mm ;第二层液体入口 22和第二层液体出口 23的距离是15mm。
[0067]第一连接通道211、第二连接通道212