、第三连接通道213相互平行。
[0068]第一真空通道14与空气通道11的距离是2mm;第二真空通道15与空气通道11的距离是2_。
[0069]本实用新型的微流控芯片上所有通道是设置于基片上的沟槽；本实用新型的微流控芯片上的细胞培养室是设置于基片上的凹槽。
[0070]实施例2实施例1中的微流控芯片的制备
[0071]实施例1中的微流控芯片的制备方法包括以下步骤:
[0072](I)用计算机辅助设计软件CAD绘制上述微流控芯片中的微通道、微结构图；将图打印在SU-8胶片(Microchem，型号为2075)上作为掩膜，采用标准光刻工艺制作模具，标准光刻工艺为本领域技术人员熟知；
[0073](2)将PDMS (Dow Corning，货号:0007883528)和固化剂按质量比10:1混匀，在真空干燥箱抽真空之后浇涂在步骤(I)制备的模具表面，80°C烘烤Ih;
[0074](3)冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相应位置钻出入口、出口，然后切割成合适大小；
[0075](4)多孔PDMS膜制作是PDMS和固化剂按质量比15:1混匀，匀胶机3000rpm，I分钟，抽真空之后浇涂在步骤(I)制备的模具表面，65°C烘制过夜；冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，备用。
[0076]实施例3模拟体内肺癌细胞转移微环境的仿生模型的构建
[0077]1、微流控芯片中肺癌细胞的2D培养
[0078](I)微流控芯片使用紫外线照射杀菌，多孔PDMS膜上包被有BME，具体包被过程为:对芯片进行预处理，以利细胞更好的附着在芯片多孔膜表面。按1:10比例稀释BME (Cultrex basement membrane extract, R&D Systems, McKinley Place, MN, USA)，充分混合后用微量加样器注入微流控芯片的样本入口，孵箱过夜等待胶凝固。
[0079](2)将微流控芯片翻转，即第三层PDMS基片朝上。将悬浮的单核细胞收集到离心管中，100rpm离心5分钟，弃上清，加入新鲜培养基制备细胞悬液。将单核细胞悬液通过第二层液体入口 22注入到液体通道21中，使其以13个/Cm2的密度种植到多孔膜PDMS膜上，之后使用注射泵以24mm/h的容积流速将PMA培养基(100ng/ml)通过第二层液体入口22注入到微流控芯片中，多余培养基通过第二层液体出口 23排除。将微流控芯片倾斜以允许细胞移动到液体通道21的一边。将芯片倾斜向一侧30度，以使单核细胞沉降到中央培养通道的一侧，置于37°C、5% CO2孵箱培养。48h后的单核细胞被刺激为巨噬细胞。
[0080](3)刺激单核细胞变成MO巨噬细胞后，将PMA培养基更换成正常培养基(1640培养基)O
[0081](4)将人类肺成纤维细胞种植以14个/cm2的密度种植到MO巨噬细胞生长的位置(待细胞增殖至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，加入新鲜的培养基吹打成细胞悬液，100rpm离心5分钟，弃上清，加入新鲜培养基，制成成纤维细胞悬液。将肺成纤维细胞WI38以14个细胞/cm2的细胞密度接种到巨噬细胞的同侧，使其附着到多孔膜表面，置于37°C、5% CO2孵箱静态条件下培养4小时。
[0082](5)将微流控芯片回复到水平状态，将血管内皮细胞悬液通过第二层液体入口 22注入到液体通道21中，使其以14个/cm 2的密度种植到多孔PDMS膜上，粘附在液体通道21的另一边。
[0083](6)待芯片多孔膜下侧细胞均贴壁生长后，翻转芯片从上侧通过第一层液体入口12以14个细胞/cm 2的细胞密度将支气管上皮细胞16HBE注入芯片，静态使其附着在膜表面4小时后，小心从第一层液体出口 13将培养基轻轻地从上部通道抽吸，继续通过第一层液体入口 12连续泵入混合培养基，置于37°C、5% CO2孵箱培养。将培养基通过第一层液体出口 13排除。
[0084](7)待上述细胞长满后，将肺癌细胞悬液通过第一层液体入口 12注入到空气通道11中，使其以13个/CHi2的密度种植到多孔PDMS膜上接种到芯片上层支气管上皮细胞区，静置4h使其贴附。将培养基通过第一层液体出口 13排除。
[0085]2、微流控芯片中脑组织细胞、骨组织细胞、肝组织细胞的3D培养
[0086](I)将星形胶质细胞、成骨细胞和肝细胞(购自中国科学院上海生科院细胞中心)使用胰酶消化，使其重悬在冰预冷的细胞基底膜提取物混合物中(购自R&D)，分别将细胞悬液与BME等体积混合。
[0087](2)将微流控芯片置于37°C环境中静置30min使BME胶化。通过第二层液体入口22将培养基注入微流控芯片中，连续泵入，于此同时，将第二层液体出口 23封住，使多余的培养基从第一入口 214、第二入口 215、第三入口 216排出。
[0088](3)将微流控芯片放置于湿度为95%、二氧化碳浓度为5%的37°C培养箱中培养(真空泵参数为 phys1logical cyclic strain (10% at 0.2Hz)。孵育时间 24h，进行后续实验。
[0089]实施例4模拟体内肺癌细胞转移微环境的仿生模型的有效性检测
[0090]评价实施例3构建的模拟体内肺癌细胞转移微环境的仿生模型的有效性，通过以下实验来完成:
[0091]1、细胞活力的检测
[0092]检测方法:在芯片系统中吸去通道中培养液，将PBS注入芯片通道内，清洗不同处理组的细胞2次；之后泵入H33342 (1:100)染色15分钟，PBS溶液清洗2次；后泵入PI染色(1:200) 5分钟，PBS溶液清洗2次；在显微镜下，观察在相应激发光激发下的荧光强度并照相记录。
[0093]2、肺癌细胞和支气管上皮细胞共定位的检测
[0094]细胞示踪剂C7000CM_DiL将肺癌细胞标记为红色:芯片接种前将肺癌细胞重悬于C7000CM_DiL 工作液中(I μ g/μ L) 37°C孵育 5min，4°C放置 15min。
[0095]3、人类支气管上皮细胞和血管内皮细胞的生长模式的观察
[0096]使用E钙粘蛋白的免疫染色检测微流控芯片中支气管上皮细胞和血管内皮细胞连接的紧密性。E钙粘蛋白免疫染色过程如下:
[0097]a、使用PBS冲洗微流控芯片中膜两侧的支气管上皮细胞和血管内皮细胞；
[0098]b、使用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.5% PBST溶液破膜10分钟，PBS溶液清洗2次。
[0099]C、将封闭血清稀释液注入芯片培养池中，放入湿盒内，37°C孵育I小时。用新鲜配制的5% BSA稀释羊封闭血清原液，按照1:100的比例稀释，用振荡器混匀；
[0100]d、使用终浓度为2 μ g/mL的E钙粘蛋白抗体(Abcam)稀释液孵育2h ；
[0101]e、使用Alexa 594偶联的二抗孵育Ih ；
[0102]f、使用终浓度为10 μ g/mL的DAPI染色，时间为15min ;使用荧光显微镜照相。
[0103]4、检测肺癌细胞、与癌相关成纤维细胞、巨噬细胞的特征
[0104]使用免疫染色的方法检测肿瘤细胞标记蛋白CEA的表达、成纤维细胞标记蛋白a -SMA的表达、巨噬细胞标记蛋白⑶206的表达，标记结果使用免疫荧光显微镜呈现。
[0105]免疫染色过程如下:
[0106]a、使用PBS清洗微流控芯片中肺癌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞；
[0107]b、使用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.5% PBST溶液破膜10分钟，PBS溶液清洗2次；
[0108]C、将封闭血清稀释液注入芯片培养池中，放入湿盒内，37°C孵育I小时；用新鲜配制的5% BSA稀释羊封闭血清原液，按照1:100的比例稀释，用振荡器混匀；
[0109]e、使用抗人CEA蛋白的抗体(1: 100, abeam)，抗人a -SMA蛋白的抗体(1:200，Santa Cruz)、抗人⑶206 蛋白的抗体(1:50，abeam)孵育 2h ;
[0110]f、使用Alexa 488或者594偶联的二抗孵育Ih ;使用终浓度为10 μ g/mL的DAPI染色，时间为15min ;使用荧光显微镜照相。
[0111]2、实验结果:
[0112]2.1细胞活力的结果:细胞活力95%以上(图8)。
[0113]2.2immunofluorescence cell tracker express1n assay 结果表明肺癌细胞A549和支气管上皮细胞16HBE共定位(图10)。
[0114]2.3E-cadherin蛋白免疫染色，实验结果表明支气管上皮细胞16HBE和血管内皮细胞HUVEC相互连接紧密(图9)。
[0115]2.4肺癌细胞中CEA表达；成纤维细胞中表达a-SMA，巨噬细胞中表达⑶206，证明了肺癌细胞与间质细胞相互作用导致间质细胞活化，成纤维细胞转化为癌相关成纤维细胞α -SM,巨噬细胞转化为癌相关巨噬细胞表达⑶206(图11)。
[0116]实施例5利用模拟体内肺癌细胞转移微环境的仿生模型监测肺癌细胞转移过程
[0117]1、步骤
[0118]1.1肺癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)的检测
[0119]通过检测上皮-间质转化(EMT)标志物蛋白:Ε钙粘蛋白、N钙粘蛋白、Snaill、Snail2的表达来评价肺癌细胞是否发生了上皮-间质转化。
[0120]免疫标记过程如下:
[0121]a、使用PBS清洗