一种氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法，属于沼 气发酵微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 在沼气发酵过程中，有机物在水解和发酵阶段、产氢产乙酸阶段等两个阶段中产 生的氢气（H2)和二氧化碳（C02)，能被氢营养型产甲烷菌群代谢生成甲烷（CH4),沼气中CH4 的产生有28%来源于这一途径，即H2还原CO2生成CH4。
[0003] 沼气中CH4含量为60%左右，CO2含量为35%左右，CO2含量超过CH4含量的一半，造 成沼气高值化利用的瓶颈，同时CO2没有得到有效利用，浪费了沼气发酵微生物生长所需的 碳源；从H2还原CO2生成CH4这一途径得到启发，若将沼气中的CO2通过H2来进行微生物还 原，必将有效提升沼气中CH4的含量，开发生物天然气，促进沼气高值化利用；产甲烷菌可分 类为乙酸营养型产甲烷菌(代谢基质为乙酸)、氢营养型产甲烷菌(代谢基质为HdPCO2)以 及甲基营养型产甲烷菌(代谢基质为甲酸、甲醇及甲胺等)，而示踪实验表明沼气发酵微生 物体系中的产甲烷菌有70%以上是乙酸营养型产甲烷菌，为了在沼气发酵体系中高效实现 H2还原CO2生成CH4，有必要采取方法促进微生物体系中氢营养型产甲烷菌群的生长；因此， 本实验设计在常温常压条件下运行沼气发酵体系，通过外源加入4和CO2基质的驯化方法， 促进沼气发酵活性污泥中氢营养型产甲烷菌群的代谢生长，以期提升氢营养型产甲烷菌群 在产甲烷菌中的含量，并获得富集了氢营养型产甲烷菌群的沼气发酵活性污泥。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化 方法。
[0005] 本发明通过以下技术方案完成： ⑴沼气发酵温度、压力：常温、常压 ⑵沼气发酵活性污泥用量：沼气发酵活性污泥用量为沼气发酵反应器容积的50%，剩 余反应器体积空间由沼液填充。
[0006] ⑶代谢基质配料：按照112还原CO2生成CH4的生化方程式4? +CO2 -CH4+ 2H20， 以H2:C02体积比4:1进行配料，并配1体积的N2作为微生物生长所需的氮源，每组实验混 合气体配料 3000mL，其中 112有 2000mL、CO2有 500mL、N2有 500mL。
[0007] ⑷驯化方法：将配好的混合气体通至湿式储气柜中，此时气柜浮罩上升至3000mL 的位置，然后利用气体循环泵将混合气体抽至沼气发酵反应器中，在沼气发酵活性污泥床 中反应后又回到气柜中，这样反复进行气体循环，随着反应进行，气柜浮罩不断下降，当浮 罩不再下降时表明反应结束。
[0008](5)沼气发酵活性污泥样品总DNA的提取、检测及测序 ①基因组DNA的提取：采用环境DNA提取试剂盒Fast DNA spin kit for soil (MP Biomedicals, LLC;www. mpbio. com)对样品进行总DNA的提取，之后采用琼脂糖凝胶电泳检 测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至lng/y1。
[0009] ②PCR扩增：稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode 的特异引物；使用NewEnglandBiolabs公司的Phusion?High-FidelityPCRMaster MixwithGCBuffer。使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。引物 对应区域：16SV4区引物为515F-806R;18SV4区引物为528F-706R;18SV9区引物为 1380F-1510R;ITS1 区引物为ITS1-5F-ITS2 ;ITS2 区引物为：ITS2-3F-ITS2-4R。
[0010] ③PCR产物的混样和纯化：PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根 据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使 用ThermoScientific公司的GeneJET胶回收试剂盒回收产物。
[0011] ④文库构建和上机测序：使用NewEnglandBiolabs公司的NEBNext?Ultra? DNALibraryPr印KitforIllumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过 Qubit定量和文库检测，合格后，使用MiSeq进行上机测序。
[0012] 本发明的作用机理：本发明通入沼气发酵反应器中的底物是H2XOjPN2,HdPCO2 作为沼气发酵微生物的代谢基质，队作为沼气发酵微生物的氮源；在气体循环过程中，氢营 养型产甲烷菌由于有充足的代谢基质4和co2，因而能在沼气发酵过程中不断生长富集，而 乙酸营养型产甲烷菌和甲基营养型产甲烷菌由于没有得到代谢基质，在沼气发酵过程中就 会不断消亡。
[0013] 本发明的有益效果：⑴本发明兼备0)2减排的环保意义、生物合成CH4的再生能源 意义和潜在经济收益等优势，有着广泛应用前景。⑵将不易被高效安全利用的H2，通入沼气 发酵体系中，与沼气中占比35%左右的CO2发生生化反应，转化为另一种清洁能源CH4，有效 提升传统沼气发酵的CH4含量，打造生物天然气，实现沼气的高值化利用。
[0014]
【附图说明】： 图1为本发明的结构示意图； 图2为本发明实施例H2还原CO2生成CH4的实验结果。
[0015]
【具体实施方式】： 实施例： ⑴H2还原CO2生成CH4的实验结果 在实验的正常运行阶段，氢营养型产甲烷菌的富集驯化共进行了 5组有效实验，这5组 有效实验的〇14生成量结果见图2。
[0016] 从图2中可以看出，第1至5组气体循环实验的CH4产量分别为185mL、258mL、 166mL、136mL、140mL，表明沼气发酵体系中的微生物能将4和0)2较好的转换成CH4;按照 H2还原0)2转换生成CH4的生化方程式4H2+CO2 -CH4+ 2H20,外源加入的2000mL4和 500mLCO2在理论上可转换生成500mLCH4，从实验结果可知，第1至5组气体循环实验的实 际〇14产量分别占理论产量的37%、51. 6%、33. 2%、27. 2%、28%，其中第2组的CH4产量最高， 达到理论值的51. 6%。
[0017] N2减少(或利用)的情况说明：第1至5组气体循环实验的N2消耗量分别为151mL、 44mL、210mL、157mL、45mL，表明在本实验条件下，通过气体循环的方式，外源加入的N2可被 沼气发酵微生物当作氮源直接利用，同时也表明富集得到的沼气发酵微生物中存在着以N2 为氮源的微生物。
[0018] ⑵产甲烷菌群落及变化分析 从图2的气体循环实验结果可知，本发明可将外源加入的HdPCO2较好的转换生成CH4，从微生物学的角度上看，应是体系中的氢营养型产甲烷菌发挥了重要作用，因此，对启 动前的沼气发酵活性污泥和第5组气体循环实验结束后的沼气发酵活性污泥分别进行总 DNA提取，应用16SrRNA基因技术对气体循环实验前后沼气发酵活性污泥中的原核微生物 群落进行研宄，比较分析原核微生物群落的前后变化情况，实验前后沼气发酵活性污泥中 产甲烷菌在古菌中的含量变化情况参见下表(表中丨表示增长、丨表示降低)。
[0019]由上表可知，专性乙酸型的甲烷鬃毛菌属含量在实验前后明显降低，从84%降低 至64%，降幅达23. 8%，这是由于本实验没有提供乙酸基质，而甲烷鬃毛菌属又不能利用H2 和CO2基质，甲烷鬃毛菌属由于缺乏代谢基质而导致含量显著降低；甲烷八叠球菌属既可以 利用乙酸基质又可以利用!1 2和CO2基质，本实验没有提供乙酸基质，但甲烧八萱球菌属在古 菌中的含量由实验前的8%提高到实验后的16%，含量增长了一倍，这是由于外源加入的H2 和CO2作为甲烷八叠球菌属的生长基质，使其不断富集生长所致；属于氢营养型的甲烷粒菌 属、甲烷袋状菌属、甲烷螺菌属、甲烷杆菌属在实验前后的含量同样发生了明显增长，增长 率分别为16. 7%、80%、150%、11. 1%，表明了本实验中外源加入的4和CO2充分促进了这些氢 营养型产甲烷菌的生长；值得注意的是，在实验前没有检测到的甲烷绳菌属、甲烷盘菌属、 甲烷泡菌属等氢营养型产甲烷菌，在实验结束后的沼气发酵活性污泥中都检测到了这些产 甲烷菌的存在，说明了通过外源加入4和CO2基质，可有效刺激能利用H2和CO2的产甲烷菌 的富集。
【主权项】
1. 一种氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法，其特征在于：在常温常压下，将配好 的混合气体通至湿式储气柜中，然后利用气体循环泵将混合气体抽至沼气发酵反应器中， 在沼气发酵活性污泥床中反应后又回到气柜中，这样反复进行气体循环。2. 根据权利要求书1中所述的混合气体，其特征是：混合气体由H2、0)2和N2构成，按 照H2还原⑶2生成CH4的生化方程式4H^ +CO2 -CH4 + 2H20,以H2:CO2体积比4:1进行配 料，并配1体积的N2，每组实验混合气体配料3000mL，其中4有2000mL、C0 2有500mL、N2有 500mT,n3. 根据权利要求书1中所述的沼气发酵活性污泥床，其特征是：沼气发酵活性污泥用 量为沼气发酵反应器容积的50%。
【专利摘要】本发明涉及一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法。本发明设计在常温常压条件下运行沼气发酵体系，通过外源加入H2和CO2基质并进行气体循环的驯化方法，促进沼气发酵活性污泥中氢营养型产甲烷菌群的生长与富集。本发明可以有效提升氢营养型产甲烷菌群在产甲烷菌中的含量，并能获得富集了氢营养型产甲烷菌群的沼气发酵活性污泥。
【IPC分类】C02F11/04
【公开号】CN104926062
【申请号】CN201510393213
【发明人】张无敌, 杨斌, 尹芳, 田光亮, 赵兴玲, 王昌梅, 柳静, 杨红, 刘士清, 毛羽
【申请人】云南师范大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月7日