专利名称：金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种纳米技术领域的制备方法，具体涉及一种金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法。
背景技术：
随着现代生命科学研究领域的不断深入，明确阐明复杂生物样品体系中功能生物大分子在生命活动中的作用与意义，以进一步探索目前严重威胁人类健康的重大疾病如癌症、心血管病等的致病机制，已成为生命科学、医学、药理学等众多相关学科关注的热点问题。在这一研究过程中，建立有效的功能蛋白质分子的分离与纯化技术，是一个十分关键性的环节。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程参与了高等真核生物细胞信号转导，细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程，建立简便、快速、高选择性的磷酸化蛋白的分离纯化技术，已成为相关领域研究工作者关注的热点问题。传统固定金属离子亲和色谱技术中使用的大多是葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等天然或合成高分子色谱基质材料，明显存在机械强度差，难以提高淋洗速度；容易滋生微生物危险的缺点。
经对现有技术的文献检索发现，J.G.Krabbe等在《Journal ofChromatography A》(《色谱学杂志》，2006，1130卷2期287-295)，发表了题为“Selective detection and identification of phosphorylated proteins by simultaneousligand-exchange fluorescence detection and mass spectrometry”(“同时通过配基交换的荧光探测以及质谱方法对磷酸化蛋白进行选择性分析及鉴定”)的文章，报道通过固定金属离子亲和色谱技术采用高分子色谱基质材料分离磷酸化蛋白质分子，但是，由于金属离子等亲和配基是通过离子间螯合作用同相应基质材料结合的，因此，淋洗过程中存在金属离子等亲和配基的流失等“瓶颈”问题，将直接影响生物分离体系中目标蛋白质分子等生物大分子的生物稳定性，使其更进一步的实际应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，使其通过调变特定形貌与组成结构的纳米沸石关键合成技术的条件，将铁和钛等金属亲和活性位点通过水热合成过程固定掺杂在相应无机纳米沸石晶体材料的骨架结构中，从而低成本、简便可控地制备得到刚性无机纳米沸石亲和色谱分离材料，特异性地实现目标低丰度磷酸化肽和磷酸化蛋白质分子的富集分离。
本发明是通过如下技术方案实现的，本发明方法具体步骤包括(1)称取固体FeCl3.6H2O，溶解于去离子水中，得到浓度为0.11-0.15moL/L呈黄色的FeCl3溶液备用；(2)在钛酸四丁酯中逐滴加入四乙基氢氧化胺，使两者的摩尔比为0.04∶1-0.06∶1，充分搅拌3-4小时，至溶液呈透明状；(3)在步骤(2)得到的溶液中加入质量百分数为80％-99％的白炭黑，快速搅拌，得到白色悬浊状溶液，将步骤(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入到该白色悬浊状溶液中，使溶液中FeCl3最终浓度为0.03-0.04moL/L，并迅速地充分搅拌；(4)将步骤(3)得到的溶液完全转移至内衬聚四氟乙烯反应容器的不锈钢反应釜中，然后在烘箱内于140-165℃下水热晶化48-72小时，反应后，将反应产物利用去离子水反复清洗，至清洗后的悬浮溶液至中性后，80-100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料。
本发明通过向骨架结构中固定掺杂不同种类金属元素(铁和钛)作为亲和活性位点，制备金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，特异性地实现目标低丰度磷酸化肽和磷酸化蛋白质分子的富集分离。
对本发明制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料进行透射电镜表征，结果表明本发明方法制备的铁和钛掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，晶体颗粒粒度均匀、形状规则、没有胶态或无定形物质存在，表明产品为纯相、结晶度很好、粒径在300-500纳米左右。此外，还对本发明制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料进行透射电镜表征进行了XRD表征，结果显示铁和钛掺杂型纳米沸石亲和色谱材料，具有铁和钛掺杂型纳米沸石的全部特征衍射峰信号。
通过本发明方法制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，具有优良的物理化学稳定性以及低反压、高流速等特性，过程中能有效避免由于金属活性位点的流失而引起的目标生物大分子的降解及结构的干扰变化，完全符合生物制品的生产规范和质量标准，可直接实现复杂生物样品体系中目标磷酸化肽和磷酸化蛋白质分子等具有特定结构的低丰度功能生物大分子的特异性富集分离与灵敏鉴定，为实验室规模和生产规模的具有特定结构的生物大分子富集分离提供一个技术平台，并可以进一步发展成为分离纯化具有特定结构的多肽、蛋白质、寡核苷酸及质粒DNA等的方法。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1(1)称取固体FeCl3.6H2O 0.196g，溶解于5.12g去离子水中，得到浓度为0.14moL/L呈黄色的FeCl3溶液备用；(2)称取固体钛酸四丁酯0.2934g，逐滴加入12.373g 25％四乙基氢氧化胺(两者摩尔比为0.06∶1)，溶液共12.7mL，然后通过磁力搅拌器充分搅拌3小时，至溶液呈透明状；(3)在步骤(2)所得溶液中加入2.346g质量百分数为99％的白炭黑，快速搅拌，得到白色悬浊状溶液，将上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3溶液的最终浓度为0.04moL/L，并迅速充分搅拌；(4)将步骤(3)所得溶液完全转移至内衬聚四氟乙烯反应容器的不锈钢反应釜中，在烘箱内140℃温度下水热晶化反应48小时，反应后，将反应产物利用去离子水反复清洗，至清洗后的悬浮溶液至中性后，100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料。
取0.5g/L的α磷酸化酪蛋白溶液5mL放入15mL离心管中，加入不同固液比(1∶1-6∶1)(g/L)的实施例1中制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，放入25℃恒温震荡水浴中，进行吸附试验，结果表明最佳固液比为4∶1(g/L)时吸附效率几乎达到了90％。
将饱和吸附α磷酸化酪蛋白的本实施例中制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，加入到5mL的1mol/L碳酸氢铵溶液中，放于25℃水浴中，振荡2小时，之后烘干上述亲和色谱分离材料，从其中取0.01g，放入0.5g/L的酪蛋白溶液5mL放入15mL离心管中，放入25℃恒温水浴中，进行吸附再生试验。吸附1小时取出，并测定上述亲和色谱分离材料的吸附效率为88％。重复以上再生实验，获得经二次再生后的吸附效率为85％。与相同条件下新鲜吸附剂的吸附效率90％基本重复。
实施例2(1)称取固体FeCl3·6H2O 0.196g，溶解于6.53g去离子水中，得到浓度为0.11moL/L呈黄色的FeCl3溶液备用；(2)称取固体钛酸四丁酯0.2g，逐滴加入20g 15％四乙基氢氧化胺(两者摩尔比为0.04∶1)，溶液共20mL，然后通过磁力搅拌器充分搅拌3.5小时，至溶液呈透明状；(3)在步骤(2)所得溶液中加入2.2g质量百分数为90％的白炭黑，快速搅拌，得到白色悬浊状溶液，将上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3的最终浓度为0.03moL/L，并迅速地充分搅拌；(4)将步骤(3)所得溶液完全转移至内衬聚四氟乙烯反应容器的不锈钢反应釜中，在烘箱内160℃温度下水热晶化反应72小时，反应后，将反应产物利用去离子水反复清洗，至清洗后的悬浮溶液至中性后，100℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料。
取0.5g/L的α磷酸化酪蛋白溶液5mL放入15mL离心管中，加入NaCL，使α磷酸化酪蛋白溶液中盐浓度(NaCL浓度)分别为0.05mol/L、0.10mol/L以及0.15mol/L，加入0.01g本实施例中制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，放入25℃恒温水浴中，进行吸附试验。1小时后取出，结果表明上述亲和色谱分离材料随着盐度的增加并没有改变α磷酸化酪蛋白与亲和色谱材料之间的结合强弱，可见α磷酸化酪蛋白与所制备的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料之间有较强的亲和性。
实施例3(1)称取固体FeCl3·6H2O 0.196g，溶解于5.12g去离子水中，得到浓度为0.11moL/L呈黄色的FeCl3溶液备用；(2)称取固体钛酸四丁酯0.3g，逐滴加入13g 25％四乙基氢氧化胺(两者摩尔比为0.055∶1)，溶液共13mL，然后通过磁力搅拌器充分搅拌4小时，至溶液呈透明状；(3)在步骤(2)所得溶液中加入3.7g质量百分数为80％的白炭黑，快速搅拌，得到白色悬浊状溶液，将上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使FeCl3的最终浓度为0.035moL/L，并迅速地充分搅拌；(4)将步骤(3)所得溶液完全转移至内衬聚四氟乙烯反应容器的不锈钢反应釜中，然后在烘箱内165℃温度下水热晶化反应48小时，反应后，将反应产物利用去离子水反复清洗，至清洗后的悬浮溶液至中性后，80℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料。
在室温操作条件下，取0.05-0.5g上述合成得到的一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石晶体亲和分离材料；配制浓度为5.0μmol/ml的α磷酸化酪蛋白、牛血清白蛋白以及马肌红蛋白的蛋白混合溶液，取0.5-1ml上述蛋白混合溶液加入到上述亲和色谱分离材料中，放置于恒温振荡器中，待蛋白混合溶液同上述亲和色谱分离材料间充分作用后，分别以去离子水和缓冲溶液反复淋洗上述亲和色谱分离材料，以除去可能的非特异性结合的蛋白质分子。
配制一系列不同梯度浓度(0.1-1.0mol/L)的碳酸氢铵缓冲溶液，充分淋洗相应的结合有目标蛋白质分子的上述亲和色谱分离材料，利用聚丙烯电泳分离鉴定根据淋洗得到的流出溶液组分，实验结果表明固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，对于蛋白混合溶液中具有磷酸化位点的α磷酸化酪蛋白具有明确的亲和选择性。
实施例4(1)称取固体FeCl3.6H2O 0.196g，溶解于4.9g去离子水中，得到浓度为0.15moL/L呈黄色的FeCl3溶液备用；(2)称取固体钛酸四丁酯0.2934g，逐滴加入12.373g 25％四乙基氢氧化胺(两者摩尔比为0.06∶1)，溶液共12.7mL，然后通过磁力搅拌器充分搅拌3.5小时，至溶液呈透明状；(3)在步骤(2)所得溶液中加入2.346g质量百分数为99％的白炭黑，快速搅拌，得到白色悬浊状溶液，将上述已配制好的FeCl3溶液逐滴加入到此溶液中，使溶液中FeCl3的最终浓度为0.04moL/L，并迅速地充分搅拌；(4)将步骤(3)所得溶液完全转移至内衬聚四氟乙烯反应容器的不锈钢反应釜中，然后在烘箱内150℃温度下水热晶化反应56小时，反应后，将反应产物利用去离子水反复清洗，至清洗后的悬浮溶液至中性后，90℃下干燥，得到一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料。
在室温操作条件下，利用内径为5-15mm的石英或玻璃材质的亲和色谱分离柱，取0.05-0.5g上述合成得到的一系列不同尺寸(300-500nm)的结构中固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料湿法均匀填柱，然后分别以3-5倍柱体积的去离子水和3-5倍柱体积的缓冲溶液反复平衡柱体。
配制浓度为1.0μmol/ml的α磷酸化酪蛋白、牛血清白蛋白以及马肌红蛋白的蛋白混合溶液，取0.5-1ml上述蛋白混合溶液滴加上柱，待蛋白混合溶液同柱体内填充材料间充分作用后，分别以去离子水和缓冲溶液反复淋洗柱体，以除去可能的非特异性结合的蛋白质分子。
配制一系列不同梯度浓度(0.1-1.0mol/L)的碳酸氢铵缓冲溶液，充分淋洗相应的结合有目标蛋白质分子的柱体，利用聚丙烯电泳分离鉴定根据淋洗得到的流出溶液组分，实验结果表明固定掺杂有铁和钛活性位点的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，对于蛋白混合溶液中具有磷酸化位点的α磷酸化酪蛋白具有明确的亲和选择性。
权利要求
1.一种金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征在于，具体步骤包括(1)称取固体FeCl3.6H2O，溶解于去离子水中，得到呈黄色的FeCl3溶液备用；(2)在钛酸四丁酯中逐滴加入四乙基氢氧化胺，搅拌至溶液呈透明状；(3)在步骤(2)得到的溶液中加入白炭黑，搅拌，得到白色悬浊状溶液，将步骤(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入到该白色悬浊状溶液中搅拌；(4)将步骤(3)得到的溶液完全转移至内衬聚四氟乙烯反应容器的不锈钢反应釜中，然后在烘箱内水热晶化，反应后，将反应产物利用去离子水反复清洗，至清洗后的悬浮溶液为中性后，干燥，得到金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料。
2.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(1)中所述的FeCl3溶液，其浓度为0.11-0.15mol/L。
3.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(2)中所述的在钛酸四丁酯中逐滴加入四乙基氢氧化胺，两者的摩尔比为0.04∶1-0.06∶1。
4.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(2)中所述的搅拌，是指搅拌3-4小时。
5.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(3)中所述的加入白炭黑，是指加入质量百分数为80％-99％的白碳黑。
6.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(3)中，所述的将步骤(1)配制好的FeCl3溶液逐滴加入白色悬浊状溶液中，是溶液中FeCl3的最终浓度为0.03-0.04mol/L。
7.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(4)中所述的水热晶化，温度为140-165℃，时间为48-72小时。
8.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，步骤(4)中所述的干燥，是指在80-100℃下干燥。
9.根据权利要求1所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料，其骨架结构中同时固定掺杂有铁和钛作为亲和活性位点。
10.根据权利要求1或9所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，其特征是，所述的金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料为纯相、粒径300-500nm。
全文摘要
一种金属掺杂型纳米沸石亲和色谱分离材料的制备方法，属于纳米技术领域。本发明方法具体步骤包括(1)称取固体FeCl
文档编号B01J20/18GK101028591SQ20071003679
公开日2007年9月5日 申请日期2007年1月25日 优先权日2007年1月25日
发明者徐芳, 王德举, 杨芃原, 张蔚霞, 杨明 申请人:上海交通大学