专利名称：一种低聚原花青素的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种提取方法，具体的涉及一种低聚原花青素的提取方法。
背景技术：
原花青素(Proantho Cyanidins, PC)广泛存在于植物中，其为一类由不同数量的黄烷-3-醇单体缩合而成的聚多酚类物质，主要由儿茶素和表儿茶素等组成，其因在酸性 介质下加热生成相应的花色素而得名。最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶单体。此外， 还有二聚体、三聚体、四聚体等，直至十聚体。按聚合度大小，通常将2 4聚体称为低聚 体(oligomeric procyanidin, 0PC)，>|夺五聚体以上禾尔为高聚体(polymeric procyanidin, PPC)。低聚原花青素(oligomeric procyanidins, OPCs)由于结构特殊，水溶性好，有效性 高，生物利用度在90%以上，易被人体吸收，成为研究的热点。低聚原花青素具有较强的抗 氧化性、清除自由基能力和对人体微循环改善的能力，是目前发现的最强、最有效的氧自由 基清除剂和脂质过氧化抑制剂之一。低聚原花青素在体内的抗氧化效果远高于维生素E和 维生素C，其在体内抗氧化能力约为维生素E的50倍，维生素C的20倍。目前，低聚原花青 素在化妆品领域以及保健食品领域得到广泛应用。国外生产的低聚原花青素制剂已成为人 们经常服用的具有延缓衰老和美容等功能的保健食品。国内外已报道了多种分离制备低聚原花青素的方法。这些方法主要是从松树皮、 葡萄籽等植物提取物中分离得到。目前，低聚原花青素的提取纯化工艺主要包括溶剂提取 法和柱层析法。溶剂提取法虽然设备简单，操作费用低，但仅采用溶剂提取法，产品纯度较 低，只能达到50%左右。柱层析法可有效提高产品纯度。现有的采用柱层析法分离提纯低 聚原花青素的报道中，主要采用聚酰胺或C18键合相硅胶作为填料。其中，聚酰胺填料虽然 价格较低，但是在进料前需要对原料进行复杂的预处理，并且由于聚合度较高的低聚原花 青素在聚酰胺上有强烈吸附，使得低聚原花青素的收率较低，且很容易使柱效降低，需要用 碱液频繁再生，不适合工业化生产。采用C18键合相硅胶作填料，虽然可以得到纯度较高的 低聚原花青素产品，但其价格昂贵，难以应用于大规模工业生产。因此，亟待寻求一种工艺 简便，成本低，易于产业化的新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的低聚原花青素的方法产品纯度和 收率不够理想，或操作繁琐，或成本较高等缺陷，而提供了一种与现有技术相比，产品纯度 和收率均有显著提高，且工艺简便，成本低，易于产业化的提取低聚原花青素的新方法。本发明的方法包括如下步骤将含低聚原花青素的植物原料用溶剂提取所得的粗 提物上大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去蛋白质和多糖类杂质，之后再用下述有机溶剂中的 一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱乙醇、甲醇和丙酮，收集以体积比为4 1 5 的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板(TLC) 上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，即得低聚原花青素提取物。
下面，对本发明的方法进行详细的介绍(1)含低聚原花青素的植物原料用溶剂提取所得的粗提物本发明中，所述的含低聚原花青素的植物原料用溶剂提取所得的粗提物可为现有技术中，植物原料经溶剂提取含有低聚原花青素的粗提物，本发明特别优选由下述原料及 方法所制得的粗提物，以更佳的配合之后的提纯步骤本发明中，所述的含低聚原花青素的植物原料可为现有文献中报道的各种含有低 聚原花青素的植物原料，如松树皮、葡萄籽和沙棘籽等。本发明优选低聚原花青素含量较高 的沙棘籽，更佳的为沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，选择该原料可实现废物利用，且较 松树皮和葡萄籽等来源更广，且成本更低。较佳的，溶剂提取前，将上述植物原料进行干燥粉碎处理。干燥的温度较佳的为 40 85°C。粉碎的颗粒的粒径较佳的为80目。本发明中，溶剂提取的方式可采用现有的各种溶剂提取方式，如常规溶剂提取、微 波辅助溶剂提取、超声溶剂提取和超临界流体萃取等。本发明中，所述的常规溶剂提取是指 不采用如微波和超声等特殊辅助手段的溶剂提取法。上述各溶剂提取方式的具体各条件可 参考本领域现有技术，本发明经优化筛选，特别优选如下条件提取溶剂较佳的为下述有机 溶剂中的一种或多种与水的混合溶剂乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮和乙酸乙酯。混合溶剂 的浓度可任意选择，较佳的为体积百分比10 95%有机溶剂的水溶液。每次提取中混合溶 剂的用量较佳的为2 20ml/lg植物原料，更佳的为3 6ml/lg植物原料。溶剂提取的温 度较佳的为10 100°C，更佳的为10 85°C。溶剂提取的次数较佳的为2 5次，更佳的 为3次。每次溶剂提取的时间较佳的为20分钟 5小时，更佳的为30 100分钟。采用微 波辅助溶剂提取时，可采用恒功率或恒温的微波辐照方式。采用超临界流体萃取时，超临界 流体较佳的为CO2，夹带剂较佳的选自甲醇、乙醇和丙酮中的一种或多种，或不使用夹带剂。本发明一较佳实例的溶剂提取的步骤中，以沙棘籽为原料，10 85°C的条件下提 取3次，每次20 100分钟，每次提取溶剂用量为3 6ml/lg沙棘籽。溶剂提取后，按常规方法，将提取液浓缩至浓缩液，或干燥得固体，即得所述的粗 提物。由上述优选溶剂提取方法制得的粗提物中，低聚原花青素含量占该粗提物固含量的 质量比> 20 %，基本都在35%以上。上述优选的溶剂提取方法，低聚原花青素含量的收率 约85%以上。(2)大孔吸附树脂柱层析本发明中，所述的大孔吸附树脂可为极性或非极性大孔吸附树脂。经大量试验 摸索，本发明特别优选下述类型的大孔吸附树脂HP-20、HP-2MG、SP207、SP850、XAD16、 XAD1600, XAD7HP、D-101、AB_8、MCI或HPD。采用上述优选的大孔吸附树脂，产品的纯度和 收率可得到尤为显著的提高。层析柱的径长比较佳的为1 5 1 45。优选的层析柱 规格为Φ12Χ500πιπι或Φ50Χ500πιπι。大孔吸附树脂的用量较佳的为上样质量的30 120 倍。步骤(1)结束后，将所得的粗提物上大孔吸附树脂柱。上样方法可为常规的湿法 上样或干法上样，优选湿法上样。采用湿法上样时，优选以0. 1 5倍柱体积/小时的流速 上样进柱。上样温度优选10 60°C。上样后，用水作洗脱剂进行洗脱，除去蛋白质和多糖等杂质。水的用量较佳的为1 8倍柱体积。用水洗脱的流速较佳的为1 5倍柱体积/小时。用水洗脱的温度较佳 的为10 60°C。之后，用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱乙醇、甲醇和丙酮。根据所选用的大孔吸附树脂的极性，在体积比0%有机溶剂(即水)和体积比 100%有机溶剂的浓度范围内选择洗脱梯度。每个梯度的洗脱液的用量较佳的为5 20柱 体积。洗脱的流速较佳的为1 5倍柱体积/小时。选择不同的洗脱剂和洗脱梯度时，收 集的洗脱梯度范围有所不同，以收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液 静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板(TLC)上Rf值为0.2 0.5的洗脱部分 为准。梯度洗脱的温度较佳的为10 60°C。本发明一较佳实例中，选择DlOl大孔吸附树脂，洗脱梯度依次为5%乙醇水溶 液，40%乙醇水溶液，纯乙醇，收集40%乙醇水溶液的洗脱部分。本发明另一较佳实例中，选择AB-8型大孔吸附树脂，洗脱梯度依次为40%丙酮 水溶液，纯丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脱部分。本发明另一较佳实例中，选择HP-20大孔吸附树脂，洗脱梯度依次为20%乙醇水 溶液，40%乙醇水溶液，纯乙醇，收集20 %乙醇水溶液的洗脱部分，以及部分40 %甲醇水溶 液的洗脱部分。本发明另一较佳实例中，选择SP207大孔吸附树脂，洗脱梯度依次为10%乙醇水 溶液、50%乙醇水溶液，纯乙醇，收集10%甲醇水溶液的洗脱部分和部分50%甲醇的洗脱 部分。上述较佳实例中，百分比为体积百分比。梯度洗脱后，将所收集的洗脱部分干燥浓缩为浓缩液，或干燥至固体，即得低聚源 花青素提取物。低聚原花青素含量占该提取物固含量的质量比>50%，基本都在80%以 上。大孔吸附树脂柱层析步骤，低聚原花青素含量的收率约80%以上。(1)中优选方法制 取粗提物和(2)的总收率约60%以上。经(2)大孔吸附树脂柱层析后，较佳的还进行(3)过凝胶柱分离提纯，以进一步提
高产品纯度。本发明中，所述的凝胶柱较佳的为葡聚糖凝胶S印hadex G系列(如G_10、G_15、 G-25、G-50、G-75、G-100、G-150 或 G-200)、葡聚糖凝胶 LH 系列(如 Sephadex LH-20，)、葡 聚糖凝胶DEAE系列(具体规格如A25，A50或FF等子系列)、葡聚糖凝胶T系列(具体规 格如T3，T4，T5，T6，T7或T9等子系列)或琼脂凝胶CL系列(如琼脂凝胶CL-4B，或琼脂 凝胶CL-6B系列。各种规格的上述类型的凝胶柱都适用本发明，优选上述列举的具体规格。 凝胶柱的径长比较佳的为1 50 1 150。洗脱剂可选择水、乙醇、甲醇、丙酮和氯仿中的一种或多种，浓度配比可任意，较佳 的为体积比10% 40%的有机溶剂的水溶液。洗脱剂用量较佳的为80 120倍柱体积。 收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开 齐U，硅胶薄层层析板(TLC)上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分为准。凝胶柱分离提纯后，将所收集的洗脱部分干燥浓缩为浓缩液，或干燥至固体，即得 低聚源花青素提取物。低聚原花青素含量占该提取物固含量的质量比不> 80%，基本都在 90%以上。过凝胶柱分离提纯步骤，低聚原花青素含量的收率约90%以上。(1)中优选方法制取粗提物、⑵和⑶的总收率60%以上。本发明的提取方法中，上述各步骤的优选条件可任意组合，即得到本发明的各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于与现有技术相比，本发明的提取方法制得的低聚源 花青素提取物产品的纯度和收率均有显著提高，经大孔吸附树脂柱层析，低聚原花青素收 率可达80%以上，产品纯度> 50%，基本都在80%以上。即使在大孔吸附树脂柱层析步 骤加上之前的溶剂提取和之后的凝胶柱提纯步骤，三步总收率仍可达60%以上，产品纯度 ^80%,基本都在90%以上。并且，本发明的方法工艺简便，成本低，易于产业化。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下述实施例中，溶液的浓度百分比均为体积百分比。下述实施例中，各提取物中低聚原花青素含量的检测方法为运用低聚原花色素 与盐酸-正丁醇的特征颜色反应测定其含量。配制含有体积比30%盐酸的正丁醇液50ml， 备用。分别取低聚原花青素体标准液(购于天津尖峰公司)lmg/ml 25ul、50ul、75ul、 IOOul，4mg/ml 50ul，加入1. 4ml盐酸-正丁醇溶液，加水使总体积到1. 5ml摇勻，于沸水中 煮30min，冷却，在波长为525nm比色，绘制标准曲线。用HPLC-MS对所得的提取物进行成分 分析，选取分子量低于1000的成分，配成lmg/ml，取0. Iml按同法测定525nm吸收度，对照 标准曲线计算低聚原花青素含量。植物原料中的低聚原花青素含量的测定方法为将植物原料溶解后，用HPLC-MS 分离分子量低于1000的成分，按上述比色法测其中低聚花青素含量。下述实施例中，总收率为产品中低聚原花青素含量/植物原料中低聚原花青素含 量 X100%o实施例11)称取250g沙棘籽(产地青海)，加入60%的乙醇水溶液600ml，搅拌提取，提取 温度控制在40°C。第一次提取时间为60min，第二次和第三次提取时间分别为20min，共提 取三次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩液。低聚原花青素含 量占该浓缩液固含量为57. 6wt%。该步骤，低聚原花青素收率为92. 7%。2)层析柱尺寸为Φ 12 X 500mm,内部装填DlOl大孔吸附树脂(上样质量50倍)。 下述操作中，温度控制在30°C。将低聚原花青素浓缩液以0. 5倍床层体积/小时的流速通 入层析柱中。进料完成后先用4倍柱体积的去离子水洗脱层析柱，流速为2倍床层体积/小 时，然后分别用5%、40%的乙醇水溶液和纯乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量为5倍 柱体积，流速为2倍床层体积/小时。收集40%乙醇水溶液的洗脱部分，浓缩干燥得到低聚 原花青素含量为91. 7衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为86. 0%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex G-IO柱(Φ 1 X 150cm)，用100倍柱体 积20%甲醇的水溶液洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水 的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗 脱部分，干燥，得到低聚原花青素含量为97. Iwt %的产品。该步骤，低聚原花青素收率为98. 6%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为78. 5%。实施例21)称取250g沙棘籽(产地青海)，加入70%的甲醇水溶液800ml，回流提取，提取温度控制在85°C。第一次提取时间为30min，第二次和第三次提取时间分别为15min，共提 取三次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩液。低聚原花青素含 量占该浓缩液固含量为38. Swt%。该步骤，低聚原花青素的收率为89. 1%。2)层析柱尺寸为Φ 12 X 500mm,内部装填AB-8型大孔吸附树脂(上样质量80倍)。 下述操作中，温度控制在30°C。低聚原花青素浓缩液以0. 3倍床层体积/小时的流速通入 层析柱中。进料完成后，先用6倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为5倍床层体积/小时， 然后分别用40%的乙醇水溶液和纯乙醇各依次进行梯度洗脱，每个梯度的用量为7倍柱体 积，流速为5倍床层体积/小时。收集40%乙醇水溶液的洗脱部分，浓缩、干燥得到低聚原 花青素含量为83. 6衬％的产品。该步骤，低聚原花青素的收率为83. 7%。3)柱层析产品用乙醇溶解，通过S印hadex G-25柱(Φ 1 X 150cm)，用80倍柱体 积的30%乙醇水溶液洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的 混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱 部分，干燥，得到低聚原花青素含量为92. 7衬％的产品。该步骤，低聚原花青素的收率为 94. 2%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为70. 3%。实施例31)称取250g沙棘籽(产地青海)，加入70%的丙酮-水溶液1000ml，超声提取， 提取温度控制在30°C。第一次提取时间为90min，第二次和第三次提取时间分别为60min， 共提取三次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩液。低聚原花青 素含量占该浓缩液固含量为47. 5wt%。该步骤，低聚原花青素的收率为91. 1%。2)层析柱尺寸为Φ50Χ500πιπι，内部装填ΗΡ-20大孔吸附树脂(上样质量100倍)。 下述操作中，温度控制在25°C。低聚原花青素浓缩液以0. 5倍床层体积/小时的流速通入 层析柱中。进料完成后先用8倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为1倍床层体积/小时， 然后用20%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和纯乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量为 10倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集20%甲醇洗脱的全部和40%甲醇洗脱的一 部分(以收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶 液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分为准)，浓缩、干燥得到低聚 原花青素含量为87. 7衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为81. 8%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex DEAE-A25柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍 柱体积的20%甲醇水溶液洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的 洗脱部分，干燥，得到低聚原花青素含量为90. 6衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为 91. 1%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为67. 9%。实施例4
1)称取250g沙棘籽(产地青海)，加入到IOOOmL的超临界流休萃取罐中，用C02 作超临界流体，流量1. 5L/min。当温度升到50°C，压力达到15MPa时开始计时。保持该条件 运行6小时，然后停止，从分离罐中分离出超临界流体萃取物。提取液经去除溶剂后得到溶 剂粗提物，提取物中低聚原花青素含量为45. 2wt%。该步骤，低聚原花青素收率为87. 3%。2)层析柱尺寸为Φ50Χ500πιπι，内部装填SP207大孔吸附树脂(上样质量120倍)。 下述操作中，温度控制在45°C。用甲醇溶解粗提物，以0. 5倍床层体积/小时的流速通入 层析柱中。进料完成后先用5倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为1倍床层体积/小时， 然后用10%乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液和纯乙醇，依次进行梯度洗脱，每个梯度用量为 8倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集10%甲醇洗脱的全部和50%甲醇洗脱的一 部分(以收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶 液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分为准)，浓缩、干燥得到低聚 原花青素含量为84. 1衬％的产品。该步骤，低聚原花青素 收率为85. 5%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex CL-4B柱(Φ 1 X 150cm)，用110倍柱 体积的20%甲醇水溶液洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水 的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗 脱部分，干燥，得到低聚原花青素含量为92. 2衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为 90. 6%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为67. 6%。实施例51)称取250g葡萄籽，加入95%的丙醇-水溶液2500ml，搅拌提取，提取温度控制 在10°C。第一次提取时间为5小时，第二次和第三次提取时间分别为3小时，第四次和第五 次提取时间分别为2小时，共提取5次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原 花青素浓缩液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含量为51. 3wt%。该步骤，低聚原花青素 的收率为89.5%。2)层析柱尺寸为Φ55Χ300πιπι，内部装填HP-2MG大孔吸附树脂(上样质量60倍)。 下述操作中，温度控制在25°C。低聚原花青素浓缩液以5倍床层体积/小时的流速通入层 析柱中。进料完成后先用8倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为1倍床层体积/小时，然 后用15%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和纯乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量为10 倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集20%甲醇洗脱的全部和40%甲醇洗脱的一部 分(以收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液 为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分为准)，浓缩、干燥得到低聚原 花青素含量为85. 3衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为82. 1%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex G-200柱(Φ 1 X 50cm)，用100倍柱体 积的水洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置 分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，干燥，得到 低聚原花青素含量为92. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为93. 1%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为68. 4%。实施例61)称取250g松树皮，加入10%的丁醇-水溶液5000ml，恒温微波提取，提取温度控制在100°C。第一次提取时间为20min，第二次提取时间为20min，共提取2次。每次提取 完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含 量为52. Iwt%。该步骤，低聚原花青素的收率为92. 5%。2)层析柱尺寸为Φ 16 X 700mm，内部装填SP850大孔吸附树脂(上样质量50倍)。下述操作中，温度控制在25°C。低聚原花青素浓缩液以0. 1倍床层体积/小时的流速通入 层析柱中。进料完成后先用7倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为2倍床层体积/小时， 然后用10%乙醇水溶液、30%的乙醇水溶液和50%乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量 为5倍柱体积，流速为2倍床层体积/小时。收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗 脱部分，浓缩、干燥得到低聚原花青素含量为82. 1衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率 为 90. 3%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过琼脂凝胶CL-6B柱(Φ 1 X 100cm)，用120倍柱体 积的甲醇洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静 置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，干燥，得 到低聚原花青素含量为93. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为89. 5%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为74. 8%。实施例71)称取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒温微波提取，控制在50°C。第一次提取时间为40min，第二次和第三次提取时间 分别为30min，共提取3次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩 液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含量为53. 5wt%。该步骤，低聚原花青素的收率为 90. 5%。2)层析柱尺寸为Φ 50 X 500mm，内部装填XAD16大孔吸附树脂(上样质量80倍)。 下述操作中，温度控制在60°C。低聚原花青素浓缩液以2倍床层体积/小时的流速通入层 析柱中。进料完成后先用8倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为4倍床层体积/小时，然 后用15%乙醇水溶液、35%的乙醇水溶液和55%乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量为 20倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水 的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱 部分，浓缩、干燥得到低聚原花青素含量为85. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为 79. 5%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过葡聚糖T6柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍柱体积的乙 醇洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层 后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，干燥，得到低聚 原花青素含量为95. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为89. 5%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为64. 4%。实施例81)称取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒温微波提取，控制在50°C。第一次提取时间为40min，第二次和第三次提取时间 分别为30min，共提取3次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含量为45. 5wt%。该步骤，低聚原花青素的收率为 92. 1%。2)层析柱尺寸为Φ 16X 300mm，内部装填XAD1600大孔吸附树脂(上样质量30 倍)。下述操作中，温度控制在25°C。低聚原花青素浓缩液以4倍床层体积/小时的流速 通入层析柱中。进料完成后先用4倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为3倍床层体积/ 小时，然后用10%乙醇水溶液、60%的乙醇水溶液和纯乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用 量为10倍柱体积，流速为5倍床层体积/小时。收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋 酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5 的洗脱部分，浓缩、干燥得到低聚原花青素含量为83. 2衬％的产品。该步骤，低聚原花青素 收率为84. 5% ο3)柱层析产品用甲醇溶解，通过琼脂凝胶CL-4B柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍柱体 积的丙酮洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静 置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，干燥，得 到低聚原花青素含量为90. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为88. 5%。
经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为68. 8%。实施例91)称取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒温微波提取，控制在50°C。第一次提取时间为40min，第二次和第三次提取时间 分别为30min，共提取3次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩 液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含量为48. 4wt%。该步骤，低聚原花青素的收率为 89. 5%。2)层析柱尺寸为Φ50Χ500πιπι，内部装填XAD7HP大孔吸附树脂(上样质量100 倍)。下述操作中，温度控制在25°C。低聚原花青素浓缩液以0.5倍床层体积/小时的流速 通入层析柱中。进料完成后先用3倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为4倍床层体积/小 时，然后用10%乙醇水溶液、30%的乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液纯乙醇依次进行梯度洗 脱，每个梯度用量为10倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集用体积比为4 1 5 的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值 为0. 2 0. 5的洗脱部分，浓缩、干燥得到低聚原花青素含量为88. 1衬％的产品。该步骤， 低聚原花青素收率为82.5%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex LH-20柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍柱体 积的氯仿洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静 置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，干燥，得 到低聚原花青素含量为94. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为88. 5%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为65. 3%。实施例101)称取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒温微波提取，控制在50°C。第一次提取时间为40min，第二次和第三次提取时间 分别为30min，共提取3次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩 液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含量为51. 7wt%。该步骤，低聚原花青素的收率为87. 5%。2)层析柱尺寸为Φ50Χ500πιπι，内部装填MCI大孔吸附树脂(上样质量90倍)。 下述操作中，温度控制在25°C。低聚原花青素浓缩液以0. 5倍床层体积/小时的流速通入 层析柱中。进料完成后先用5倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为2倍床层体积/小时， 然后用30%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和50%乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量 为10倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸 和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的 洗脱部分，浓缩、干燥得到低聚原花青素含量为83. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收 率为86. 5%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex DEAE-A50柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍 柱体积的40%甲醇水溶液洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的 洗脱部分，干燥，得到低聚原花青素含量为91. 5衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为 92. 9%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为70. 3%。实施例111)称取250g沙棘提取完沙棘油后的沙棘籽渣滓，加入50%的乙酸乙酯-水溶液 1000ml，恒温微波提取，控制在50°C。第一次提取时间为40min，第二次和第三次提取时间 分别为30min，共提取3次。每次提取完成后过滤，合并滤液，浓缩得到低聚原花青素浓缩 液。低聚原花青素含量占该浓缩液固含量为50. 3wt%。该步骤，低聚原花青素的收率为 92. 4%。2)层析柱尺寸为Φ50Χ500πιπι，内部装填HPD大孔吸附树脂(上样质量90倍)。 下述操作中，温度控制在10°c。低聚原花青素浓缩液以0. 5倍床层体积/小时的流速通入 层析柱中。进料完成后先用1倍柱体积去离子水洗脱层析柱，流速为1倍床层体积/小时， 然后用10%乙醇水溶液、40%的乙醇水溶液和70%乙醇依次进行梯度洗脱，每个梯度用量 为10倍柱体积，流速为1倍床层体积/小时。收集用体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸 和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的 洗脱部分，浓缩、干燥得到低聚原花青素含量为84. 3衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收 率为80. 5%。3)柱层析产品用甲醇溶解，通过S印hadex DEAE-A25柱(Φ 1 X 150cm)，用120倍 柱体积的10%甲醇水溶液洗脱，对照标准品，收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和 水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板 上Rf值为0. 2 0. 5的 洗脱部分，干燥，得到低聚原花青素含量为92. 1衬％的产品。该步骤，低聚原花青素收率为 87. 5%。经过溶剂提取、柱层析和凝胶三步，低聚原花青素总收率为65. 0%。
权利要求
一种提取低聚原花青素的方法，其特征在于其包括如下步骤将含低聚原花青素的植物原料用溶剂提取所得的粗提物上大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去蛋白质和多糖类杂质，之后再用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱乙醇、甲醇和丙酮，收集以体积比为4∶1∶5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分，即得低聚原花青素提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含低聚原花青素的植物原料为松树 皮、葡萄籽或沙棘籽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的沙棘籽为沙棘提取完沙棘油后的沙 棘籽渣滓。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的溶剂提取的方式为常规溶剂提取、微 波辅助溶剂提取、超声溶剂提取或超临界流体萃取。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的溶剂提取中，提取溶剂为下述有机溶剂中的一种或多种与水的混合溶剂乙醇、 甲醇、丙醇、丁醇、丙酮和乙酸乙酯；混合溶剂的浓度为体积百分比10 95%有机溶剂的 水溶液；每次提取中，混合溶剂的用量为2 20ml/lg植物原料；溶剂提取的温度为10 IOO0C ；溶剂提取的次数为2 5次；每次溶剂提取的时间为20分钟 5小时；采用微波辅助溶剂提取时，采用恒功率或恒温的微波辐照方式；采用超临界流体萃取时，超临界流体为CO2,夹带剂选自甲醇、乙醇和丙酮中的一种或 多种，或不使用夹带剂。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为下述类型的大孔吸 附树脂HP-20、HP-2MG、SP207、SP850、XAD16、XAD1600, XAD7HP、D-101、AB-8、MCI 或 HPD。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂的径长比为1 5 1 45;大孔吸附树脂的用量为上样质量的30 120倍。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于将粗提物上大孔吸附树脂柱的上样方法为 湿法上样，以0. 1 5倍柱体积/小时的流速上样进柱，上样温度为10 60°C。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的用水洗脱除去蛋白质和多糖类杂质 的步骤中，水的用量为1 8倍柱体积，用水洗脱的流速为1 5倍柱体积/小时，用水洗 脱的温度为10 60°C。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的梯度洗脱的洗脱梯度在体积比0% 有机溶剂和体积比100%有机溶剂的浓度范围内选择，每个梯度的洗脱液的用量为5 20 柱体积，洗脱的流速为1 5倍柱体积/小时，梯度洗脱的温度为10 60°C。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂柱为DlOl大孔吸附树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依次为 5 %乙醇水溶液，40 %乙醇水溶液，纯乙醇，收集40 %乙醇水溶液的洗脱部分；或者，所述的大孔吸附树脂柱为AB-8型大孔吸附树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度 依次为40%丙酮水溶液，纯丙酮，收集40%丙酮水溶液的洗脱部分；或者，所述的大孔吸附树脂柱为HP-20大孔吸附树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依 次为20%甲醇水溶液，40%甲醇水溶液，纯甲醇，收集20%甲醇水溶液的洗脱部分，以及部 分40%甲醇水溶液的洗脱部分；或者，所述的大孔吸附树脂柱为SP207大孔吸附树脂，所述的梯度洗脱中，洗脱梯度依 次为10%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液，纯乙醇，收集10%甲醇水溶液的洗脱部分和部分 50%甲醇的洗脱部分； 百分比为体积百分比。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于将权利要求1的方法所制得的低聚原花青 素提取物再进行凝胶柱分离提纯，以水、乙醇、甲醇、丙酮和氯仿中的一种或多种为洗脱剂， 收集以体积比为4 1 5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开 剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0. 2 0. 5的洗脱部分，即得进一步提纯后的低聚原花青素 提取物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述的凝胶柱为葡聚糖凝胶G系列、葡聚 糖凝胶LH系列、葡聚糖凝胶DEAE系列、葡聚糖凝胶T系列或琼脂凝胶CL系列。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述的凝胶柱的径长比为1 50 1 150。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述的洗脱剂为浓度配比为体积比 10% 40%的有机溶剂的水溶液，洗脱剂用量为80 120倍柱体积。
全文摘要
本发明公开了一种提取低聚原花青素的方法，其包括如下步骤将含低聚原花青素的植物原料用溶剂提取所得的粗提物上大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去蛋白质和多糖类杂质，之后再用下述有机溶剂中的一种或多种与水作为洗脱剂进行梯度洗脱乙醇、甲醇和丙酮，收集以体积比为4∶1∶5的正丁醇、醋酸和水的混合溶液静置分层后的上层溶液为展开剂，硅胶薄层层析板上Rf值为0.2～0.5的洗脱部分，即得低聚原花青素提取物。较现有技术，本发明的方法纯度和收率均有显著提高，低聚原花青素收率可达80％以上，产品纯度≥50％，基本都在80％以上，且该方法工艺简便，成本低，易于产业化。
文档编号B01J20/26GK101845035SQ20091004806
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者夏玉叶, 王曙光, 盖春艳, 闵旸, 陈述增, 韩竹箴, 高雯 申请人:上海医药工业研究院