一种复合仿生矿化纳米生物催化剂的制备方法与流程

本发明属于固定化酶领域，特别是提出了采用聚丙烯酰胺、金属有机骨架材料作为保护层来制备复合仿生矿化纳米生物催化剂的方法。

背景技术：

酶作为生物催化剂，具备反应条件温和、来源广泛、无污染、催化效率高、催化专一等优点而受到了人们青睐。但是游离酶稳定性差、难回收利用、易失活的缺点，不仅限制了其广泛应用而且增加了应用成本。为了解决这项难题，克服游离酶难以分离回收等缺点，固定化酶的理念应运而生，酶被固定化后经过简单的离心等操作即可分离出来，可实现多次重复使用；它还可以提高酶的热稳定性和对反复使用过程中溶剂的耐受性，避免某些操作步骤对酶活造成影响；相对于游离酶来讲，固定化酶的储藏稳定性也大大提高，不易被蛋白酶水解影响催化功能。总之，固定化酶的出现使生物酶在工业上的自动化生产和连续控制成为可能，同时在理论方面也为酶促反应机理及动力学的研究提供了良好的模型。

金属有机骨架结构材料(MOFs)由于其比表面积大、制备条件温和、制备过程可控等优点，将其应用于包埋法固定化酶克服了其他固定化方法操作复杂、费用昂贵等缺点，成为目前常用的固定化酶材料之一。MOFs固定化酶展现出较好的催化性能，但是由于其对酸性环境不耐受且采用直接包埋法酶分子与反应体系依然直接接触损伤酶活，不利于酶促反应的持续高效进行，所以不适合反应体系环境极端的酶促反应。

单酶微囊利用生物亲和性高分子聚合物将酶分子包裹于微囊中加以保护，已有较多文献进行报道，微囊外壳的存在保护酶分子在高热环境下酶的三维构象难以发生改变，从而使其具备非常高的热稳定性；另外，微囊的存在使得蛋白酶等难以直接接触酶分子，从而提高了酶的广泛工业应用可能性。但是单酶微囊由于其粒径过小，难于分离回收，极大地限制了其工业应用价值。因此，对单酶微囊再次固定化从而达到可回收的目的值得进一步的研究。

为了解决固定化酶酶活损失快、重复使用稳定性差等问题，我们提出了采用MOFs材料仿生矿化固定化单酶微囊(即复合仿生矿化纳米生物催化剂)的思想：本专利采用纳米聚丙烯酰胺微囊对酶分子进行预包覆，再利用MOFs材料对纳米微囊进行包埋固定化，构建新型纳米生物催化剂，利用聚丙烯酰胺对酶分子的保护作用，能够大幅度的提高催化剂的热稳定性和重复使用稳定性，同时，利用MOFs材料对单酶微囊进行再次固定从而进行回收利用，大幅度增加其工业应用价值。

关于制备MOFs固定化酶和聚丙烯酰胺微囊固定化酶的文献报道包括：文献1:Journal of the American Chemical Society,2015,137,4276-4279将2-甲醛基-咪唑溶液与硝酸锌溶液混合，随后加入过氧化氢酶(CAT)制备其共沉物即为固定化酶。通过这种技术获得的MOFs固定化酶(CAT@ZIF-90)实现了温和水相一步合成MOFs固定化酶，具备较高的过氧化氢分解反应催化活性。文献2:Nano letters,2014,14,5761-5765和文献3:Journal of the American Chemical Society,2012,134,13188-13191分别制备了两种MOFs材料固定化细胞色素C(CytC)，并进行了展现了较好的催化性能，并发现其在溶剂耐受性方面有着突出表现。文献4:Chemical Communications,2015,51,13408-13411通过共沉淀方法将葡糖氧化酶和辣根过氧化物酶同时固定于ZIF-8中，制备条件温和并且环境友好，所得固定化酶的贮藏稳定性和耐变性剂能力较游离酶有飞跃式的提高。文献5:Journal of the American Chemical Society,2006,128,11008-11009将辣根过氧化物酶成功的固定于聚丙烯酰胺(PAAM)微囊中，对其催化性能研究后发现，其热稳定性和有机溶剂耐受性远远高于游离酶，构建了一种新的固定化方法。文献6:Chemical Communications,2015,51,9628-9631将有机磷降解酶固定于聚丙烯酰胺微囊并展现了杰出的热稳定性和溶剂稳定性。

以上相关文献所述制备MOFs固定化酶技术和微囊固定化酶技术，虽然能得到不同类型的MOFs固定化酶，然而并无法解决MOFs及其固定化酶在极性条件下不稳定的劣势，而本发明提出的MOFs材料仿生矿化固定化单酶微囊(即仿生矿化固定化酶)杂化生物纳米催化剂的方法，可以制备出酶稳定性较大提升的复合仿生矿化纳米生物催化剂，在催化反应时避免了传统MOFs固定化酶酶活损失较快和单酶微囊难以回收再利用的难题。

技术实现要素：

本发明的目的为针对当前技术的不足，提供一种复合仿生矿化纳米生物催化剂的制备方法，该方法通过将MOF材料固定化酶和微囊固定化酶这两种固定化方法的结合，同时克服了两种固定化酶的各自的缺点。由于采取了将MOF材料装甲于微囊外面即ZIF-8矿化层的形成步骤，以及以2-甲基咪唑和二水合醋酸锌为核心原料，解决了MOF材料固定化酶极端环境酶活损失较快和纳米微囊难以回收两个关键技术问题。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

一种复合仿生矿化纳米生物催化剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)酶的修饰：将酶与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)加入到磷酸缓冲液PBS中溶解，得到酶浓度为1-3mg·mL^-1的溶液，然后在4-8℃,磁力下酰化反应1-2h，得到预修饰后的酶溶液中；

所述的酶为青霉素酰化酶(PGA)、脂肪酶CALB或过氧化氢酶(CAT)；摩尔比酶：N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)＝1:(3-6)；

(2)单酶微囊的形成：依次将单体丙烯酰胺(AAM),N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)加入到预修饰后的酶溶液中，搅拌后再加入触发剂过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)，4-8℃,磁力搅拌反应3-4h，然后将所得溶液放入透析袋中，再将透析袋在10-20℃的纯水中透析6-12h，最后用聚乙二醇20000将透析袋内液体进行浓缩恢复到透析前体积，得到微囊溶液；

其中，摩尔比酶:单体丙烯酰胺(AAM):N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM):N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)＝1:(2200-2600):(400-600):(160-240)；同时，摩尔比过硫酸铵(APS):四甲基乙二胺(TEMED)＝(600-800):1，质量比过硫酸铵(APS):酶＝(1.2-2):1；

(3)ZIF-8矿化层的形成：将Zn²⁺溶液至于15-30℃的容器中；再取步骤(2)所得微囊溶液加入到2-MeIM溶液中，混合后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，15-30℃下搅拌25-40min；离心9-15min，转速为3000-7000r/min，最后沉淀用PBS洗涤，得到复合仿生矿化纳米生物催化剂；

其中，2-MeIM溶液的浓度为300-700mmol L^-1，Zn²⁺溶液的浓度为120-400mmol L^-1；体积比2-MeIM溶液:Zn²⁺溶液＝(8-12):1；体积比2-MeIM溶液:微囊溶液＝8:1。

所述的磷酸缓冲溶液(PBS)的配制：分别配制0.1mol/L的Na₂HPO₄溶液和0.1mol/L的NaH₂PO₄溶液；按照体积比Na₂HPO₄/NaH₂PO₄为2:1的比例混合两种溶液，即可得到pH值7.0的磷酸缓冲溶液(PBS)。

所述的Zn²⁺溶液为二水合醋酸锌溶液。

本发明的实质性特点为：

该方法在传统的MOFs固定化酶技术的基础上，实现了单酶微囊的预保护，聚丙烯酰胺微囊的存在增加了固定化酶的溶剂稳定性和使用稳定性，赋予其在工业应用中更好的潜力。此外，所制备的固定化酶还保留了MOFs固定化酶的介孔结构，具有较高的比表面积。这种结构更有利于物质从向固定化酶内部传递，降低物质传质阻力，为底物和产物的扩散提供了较高的流速和效率；同时，合成条件温和对酶损伤较小。具体体现在：1在室温水相条件下合成MOF晶体进行微囊的固定化，条件温和，简便易行。2选择聚丙稀酰胺对酶进行预固定，即降低了MOFs矿化过程中对酶活造成的损害，又实现了单酶微囊的简易回收；3酶表面覆盖的PAAM保护层确保了酶分子与反应体系隔离，保护酶分子不受大分子有毒物质伤害；4目前没有报道制备MOFs材料仿生矿化固定化单酶微囊，已有的关于MOFs和微囊固定化酶的报道都是存在稳定性差或难以回收利用以致无法工业化的。

本发明的有益效果是：

1.本发明制备固定化酶的方法，操作简单，推广性强，对于不同酶的普遍适用性较好(其中已验证了此方案对过氧化氢酶、青霉素酰化酶和脂肪酶CALB的可行性)。

2.本发明所得固定化酶大小较为均一，粒子为近似菱形正十二面体晶体(见附图2)，比表面积为604.7m²g^-1，孔径和孔体积较纯ZIF-8晶体均有所增加，由这样能在很大的程度增加传质效率。而其他方法制备的MOFs固定化酶孔径较小，不利于传质。本发明所得固定化酶具有较好的晶体晶型和单分散度，催化剂在使用过程中较为稳定。

3.本发明所得的固定化酶对高温很好的耐受性。在65℃高温下浸泡60min后，仍能保持初始酶活的87％，而游离酶在65℃高温下浸泡60min后，活性仅为初始活性的5％。

4.本发明得到的固定化重复使用稳定性高，在重复催化反应10次后仍能保持92％的初始酶活，可见本发明制备的固定化酶所增加了其工业应用价值，降低了平均批次成本投入。

5.本发明得到的固定化酶贮藏稳定性强，在4℃下的PBS缓冲溶液中浸泡27天以后活性仍然能保持在初始酶活的95％以上，而游离酶仅可保留30％的初始酶活。

6.本发明反应主要涉及水相，安全无污染，并且利用MOFs进行微囊的固定化就解决了微囊本身难以回收的技术难题。(微囊颗粒的粒径只有15-40nm，作为固定化酶回收利用条件苛刻(色谱柱层析)。)

附图说明

图1为仿生矿化纳米生物催化剂流程图(以CAT为例，三个步骤分别对应本说明书技术方案中一种复合仿生矿化纳米生物催化剂的制备方法制备步骤)；

图2为实施例1中过氧化氢酶仿生矿化纳米生物催化剂的荧光标记后的激光共聚焦显微镜照片，制备的纳米催化剂颗粒具有明显荧光，可以认为纳米酶微囊被成功的固定于MOFs粒子中；

图3为实施例1中过氧化氢酶仿生矿化纳米生物催化剂的制备方法的扫描电镜和透射电镜照片，其中图3(a)为扫描电镜照片；图3(b)为透射电镜照片，由图中可以看出得到的固定化酶中包埋或镶嵌着15-40nm的纳米酶微囊，进一步证明了固定化微囊即仿生矿化纳米催化剂的成功制备。

具体实施方式

本发明所用的过氧化氢酶购自于上海源叶生物科技有限公司。

本发明所用的青霉素酰化酶和脂肪酶CALB购自于北京鼎国生物技术有限责任公司。

本发明所用的2-甲基咪唑购自于上海阿拉丁生化试剂有限公司。

本发明所用的青霉素钾盐购自于天津市福晨化学试剂厂；本发明所用其他试剂均为分析纯。

本发明所述磷酸盐缓冲溶液(PBS):0.05mol/L Na₂HPO₄/L的和0.05mol/L NaH₂PO₄溶液按照体积比2:1混合而成；

本发明所用的电子天平购自于上海精科天平厂。

本发明所用的无菌注射器购自于上海精密科学仪器有限公司。

实施例1：

按照摩尔比将30mg过氧化氢酶：N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)＝1:5的比例，将30mg(0.5μmol)过氧化氢酶与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)(2.5μmol)溶于20mL的PBS中开始酰化反应，反应容器为100mL三口烧瓶，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应2h。将预修饰后的PGA按摩尔比1:2500:500:200依次加入单体丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)。搅拌均匀后加入触发剂过硫酸铵(APS)60mg和50μL四甲基乙二胺(TEMED)，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应4h。将所得棕黄色溶液20mL转移至50mL透析袋中，置于1000mL的纯水的烧杯中开始透析，透析应15℃水浴条件下进行，给予200r/min搅拌纯水加速透析，透析过程中每当透析液颜色与透析袋内颜色接近时更换透析液，透析进行约12h即可。随后将透析袋置于盛有500g聚乙二醇20000的1000mL烧杯内将透析袋内液体进行浓缩至液体体积为20mL后，转移至50mL试管4℃条件下保存待用，标记为nCAT。

称取0.9852g的2-MeIM(2-甲基咪唑溶液)溶于40mL蒸馏水(浓度为300mmol)中，称取0.2722g的Zn(OAC)₂·2H₂O溶于4mL蒸馏水中(浓度为310mmol)。将Zn²⁺溶液放置于25℃水浴的磁力搅拌的三口烧瓶中，取5mL nCAT加入到2-MeIM溶液中，混匀后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，780r/min磁力搅拌，25℃恒温水浴30min。离心9min，转速为7000r/min，将沉淀用PBS洗一次。所得产品即为仿生矿化纳米生物催化剂，于4℃下保存待用。所制备的仿生矿化纳米生物催化剂，制备过程中将酶分子事先荧光标记后制备所得催化剂进行激光共聚焦显微镜表征(附图2)，进行扫描电镜和透射电镜表征(附图3)，可以看到微囊被成功固定于MOFs材料中，晶体粒子较为完整且晶型较好，存在介孔便于底物和酶分子的接触以及产物的扩散传质。利于催化反应的进行。

将其应用于过氧化氢的去除反应中(过氧化氢去除率的测定方法：称取10mg固定化酶溶解于2ml PBS(7.0)溶液中，取固定化酶溶液200μl加入到2.8ml PBS(7.0)中，记1号。取固定化酶溶液200μl加入到2.5ml PBS(7.0)中，记2号。取5.7ml PBS(7.0)，记3号。将1号溶液，2号溶液加入300μL过氧化氢水溶液，3号溶液只加入300μL过氧化氢水溶液，均反应15s后过滤待测。利用紫外分光光度计在240nm下对过滤后的样品进行测定，并记录数据。OD值通过H₂O₂浓度标准曲线折合成为H₂O₂浓度。)

过氧化氢去除率的计算公式如下：

过氧化氢去除率(％)＝[(C₀-C_f)/C₀]*100％

C₀和C_f分别为苯酚初浓度和去除后浓度。通过分光光度计测量反应前后体系吸光值变化进一步根据标准曲线计算过氧化氢的浓度变化。H₂O₂去除率可达66.5％，重复使用十次之后活性保持初始活性的87％，具有较高的重复使用稳定性，大大提升了催化剂的重复使用性能，可以大幅度降低工业应用成本。

实施例2：

将30mg过氧化氢酶(0.5μmol)与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)(2.5μmol)按摩尔比1:5的比例溶于20mL的PBS中开始酰化反应，反应容器为100mL三口烧瓶，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应2h。将预修饰后的PGA按摩尔比1:2500:500:200依次加入单体丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)。搅拌均匀后加入触发剂过硫酸铵(APS)60mg和50μL四甲基乙二胺(TEMED)，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应4h。将所得20mL棕黄色溶液转移至50mL透析袋中，置于1000mL的纯水的烧杯中开始透析，透析应15℃水浴条件下进行，给予200r/min搅拌加速透析，透析过程中每当透析液颜色与透析袋内颜色接近时更换透析液，透析进行约12h即可。随后将透析袋置于盛有500g聚乙二醇20000的1000mL烧杯内将透析袋内液体进行浓缩至液体体积为后转移20mL至50mL试管4℃条件下保存待用，标记为nCAT。

称取1.3136g的2-MeIM溶于40mL蒸馏水中(浓度为400mmol)，称取0.2722g的Zn(OAC)₂·2H₂O溶于4mL蒸馏水中(浓度为310mmol)。将Zn²⁺溶液至于25℃水浴的磁力搅拌的三口烧瓶中，取5mL nCAT加入到2-MeIM溶液中，混匀后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，780r/min磁力搅拌，25℃恒温水浴30min。离心9min，转速为7000r/min，将沉淀用PBS洗一次。所得产品即为仿生矿化纳米生物催化剂，于4℃下保存待用。所制备的仿生矿化纳米生物催化剂，制备过程中将酶分子事先荧光标记后制备所得催化剂进行激光共聚焦显微镜表征、扫描电镜和透射电镜表征与实施例1相似，可以看到微囊被成功固定于MOFs材料中，晶体粒子较为完整且晶型较好，存在介孔便于底物和酶分子的接触以及产物的扩散传质。利于催化反应的进行。

将所得催化剂用于实施例1相同反应，H₂O₂去除率可达68.5％，重复使用十次之后活性保持初始活性的89％，具有较高的重复使用稳定性，大大提升了催化剂的重复使用性能，降低工业应用成本，并且无论是H₂O₂去除率还是重复使用稳定性都较实施例1有所提升。

实施例3：

将30mg过氧化氢酶(0.5μmol)与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)(2.5μmol)按摩尔比1:5的比例溶于20mL的PBS中开始酰化反应，反应容器为100mL三口烧瓶，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应2h。将预修饰后的PGA按摩尔比1:2500:500:200依次加入单体丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)。搅拌均匀后加入触发剂过硫酸铵(APS)60mg和50μL四甲基乙二胺(TEMED)，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应4h。将所得20mL棕黄色溶液转移至50mL透析袋中，置于1000mL的纯水的烧杯中开始透析，透析应20℃水浴条件下进行，给予200r/min搅拌加速透析，透析过程中每当透析液颜色与透析袋内颜色接近时更换透析液，透析进行约12h即可。随后将透析袋置于盛有500g聚乙二醇20000的1000mL烧杯内将透析袋内液体进行浓缩至液体体积为20mL后转移至50mL试管4℃条件下保存待用，标记为nCAT。

称取1.9704g的2-MeIM溶于40mL蒸馏水中(浓度为600mmol)，称取0.2722g的Zn(OAC)₂·2H₂O溶于4mL蒸馏水中(浓度为310mmol)。将Zn²⁺溶液至于25℃水浴的磁力搅拌的三口烧瓶中，取5mL nCAT加入到2-MeIM溶液中，混匀后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，780r/min磁力搅拌，25℃恒温水浴30min。离心9min，转速为7000r/min，将沉淀用PBS洗一次。所得产品即为仿生矿化纳米生物催化剂，于4℃下保存待用。所制备的仿生矿化纳米生物催化剂，制备过程中将酶分子事先荧光标记后制备所得催化剂进行激光共聚焦显微镜表征、扫描电镜和透射电镜表征与实施例1相似，可以看到微囊被成功固定于MOFs材料中，晶体粒子较为完整且晶型较好，存在介孔便于底物和酶分子的接触以及产物的扩散传质。利于催化反应的进行。

将所得催化剂用于实施例1相同反应，H₂O₂去除率可达88.5％，重复使用十次之后活性保持初始活性的92％，具有很高的重复使用稳定性，大大提升了催化剂的重复使用性能，大幅降低工业应用成本，并且无论是H₂O₂去除率还是重复使用稳定性都较实施例1、实施例2有所提升。

实施例4：

将30mg脂肪酶CALB(0.857μmol)与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)(4.285μmol)按摩尔比1:5的比例溶于20mL的PBS中开始酰化反应，反应容器为100mL三口烧瓶，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应2h。将预修饰后的PGA按摩尔比1:2500:500:200依次加入单体丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)。搅拌均匀后加入触发剂过硫酸铵(APS)60mg和50μL四甲基乙二胺(TEMED)，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应4h。将所得深棕黄色溶液20mL转移至50mL透析袋中，置于1000mL的纯水的烧杯中开始透析，透析应10℃水浴条件下进行，给予200r/min搅拌加速透析，透析过程中每当透析液颜色与透析袋内颜色接近时更换透析液，透析进行约12h即可。随后将透析袋置于盛有500g聚乙二醇20000的1000mL烧杯内将透析袋内液体进行浓缩至液体体积为20mL后转移至50mL试管4℃条件下保存待用，标记为nCALB。

称取1.9704g的2-MeIM溶于40mL蒸馏水中(浓度为600mmol)，称取0.2722g的Zn(OAC)₂·2H₂O溶于4mL蒸馏水中(浓度为310mmol)。将Zn²⁺溶液至于25℃水浴的磁力搅拌的三口烧瓶中，取5mL nPGA加入到2-MeIM溶液中，混匀后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，780r/min磁力搅拌，25℃恒温水浴30min。离心9min，转速为7000r/min，将沉淀用PBS洗一次。所得产品即为仿生矿化纳米生物催化剂，于4℃下保存待用。所制备的仿生矿化纳米生物催化剂，制备过程中将酶分子事先荧光标记后制备所得催化剂进行激光共聚焦显微镜表征、扫描电镜和透射电镜表征与实施例1相似，可以看到微囊被成功固定于MOFs材料中，晶体粒子较为完整且晶型较好，存在介孔便于底物和酶分子的接触以及产物的扩散传质。利于催化反应的进行。

用对硝基苯基棕榈酸酯来检测其水解活性(所得脂肪酶活性测定：取100μL 5mg/mL的4-硝基苯基棕榈酸酯(p-NPP)，加入到5mL所得脂肪酶悬浮液中，室温条件下反应1min后，取2mL反应液与2mL 0.25M Na₂CO₃混合终止反应，10000r/min离心5min，取上清液在可见分光光度计410nm下测定OD值。根据OD值，通过标准曲线可知对硝基苯酚的含量，酶活定义为：在检测条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。通过分光光度计测量产物的含量，可知酶活为800U/g酶蛋白。重复使用10次后保留初始酶活的81％，具有了较高的重复使用性能；同时70℃下处理12h仍能保持初始酶活的75％，而游离酶在处理1h时已完全失活，固定化酶的热稳定性大幅度提升，增大了酶的应用可能，大幅度较低工业成本。

实施例5：

将30mg青霉素酰化酶(0.3797μmol)与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)(1.898μmol)按摩尔比1:5的比例溶于20mL的PBS中开始酰化反应，反应容器为100mL三口烧瓶，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应2h。将预修饰后的PGA按摩尔比1:2500:500:200依次加入单体丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)。搅拌均匀后加入触发剂过硫酸铵(APS)60mg和50μL四甲基乙二胺(TEMED)，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应4h。将所得深棕黄色溶液20mL转移至50mL透析袋中，置于1000mL的纯水的烧杯中开始透析，透析应20℃水浴条件下进行，给予200r/min搅拌加速透析，透析过程中每当透析液颜色与透析袋内颜色接近时更换透析液，透析进行约12h即可。随后将透析袋置于盛有500g聚乙二醇20000的1000mL烧杯内将透析袋内液体进行浓缩至液体体积为20mL后转移至50mL试管4℃条件下保存待用，标记为nPGA。

称取0.9852g的2-MeIM溶于40mL蒸馏水中(浓度为300mmol)，称取0.2722g的Zn(OAC)₂·2H₂O溶于4mL蒸馏水中(浓度为310mmol)。将Zn²⁺溶液至于25℃水浴的磁力搅拌的三口烧瓶中，取5mL nPGA加入到2-MeIM溶液中，混匀后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，780r/min磁力搅拌，25℃恒温水浴30min。离心9min，转速为7000r/min，将沉淀用PBS洗一次。所得产品即为仿生矿化纳米生物催化剂，于4℃下保存待用。所制备的仿生矿化纳米生物催化剂，制备过程中将酶分子事先荧光标记后制备所得催化剂进行激光共聚焦显微镜表征、扫描电镜和透射电镜表征与实施例1相似，可以看到微囊被成功固定于MOFs材料中，晶体粒子较为完整且晶型较好，存在介孔便于底物和酶分子的接触以及产物的扩散传质。利于催化反应的进行。

用其催化青霉素G钾盐分解反应(所得催化剂活性测定方法：取一定质量的所得催化剂置于1mL pH 7.0的PBS中，在37℃水浴锅中预热5min后，加入1mL 4％的青霉素G钾盐溶液，磁搅反应3min后，取出1mL反应液与3mL pH 2.5的醋酸缓冲液、1mL PDAB溶液避光显色10min，单层滤膜过滤后，用紫外分光光度计415nm下测其OD值。根据OD值对比产物的标准曲线，可知产物生成量。绝对酶活定义：在上述反应条件下，每1min催化生成1μmol产物所需催化剂的质量定义为1U。)通过分光光度计测量产物的生成量，可知活性为850U/g酶蛋白。重复使用10次后保留初始酶活的85％，具有了较高的重复使用性能；同时55℃下处理3h仍能保持初始酶活的82％，而游离酶在处理15min时已完全失活，固定化酶的热稳定性大幅度提升，增大了酶的应用可能，大幅度较低工业成本。

实施例6：

将30mg青霉素酰化酶(0.3797μmol)与N-丙烯酰氧基琥珀酰胺(NASM)(1.898μmol)按摩尔比1:5的比例溶于20mL的PBS中开始酰化反应，反应容器为100mL三口烧瓶，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应2h。将预修饰后的PGA按摩尔比1:2500:500:200依次加入单体丙烯酰胺(AAM)和N-(3-氨丙基)-甲基丙烯酯(APM)，交联剂N,N’-亚甲基丙烯酰胺(BIS)。搅拌均匀后加入触发剂过硫酸铵(APS)60mg和50μL四甲基乙二胺(TEMED)，4℃恒温水浴，同时520r/min磁力搅拌反应4h。将所得深棕黄色溶液20mL转移至50mL透析袋中，置于1000mL的纯水的烧杯中开始透析，透析应20℃水浴条件下进行，给予200r/min搅拌加速透析，透析过程中每当透析液颜色与透析袋内颜色接近时更换透析液，透析进行约12h即可。随后将透析袋置于盛有500g聚乙二醇20000的1000mL烧杯内将透析袋内液体进行浓缩至液体体积为20mL后转移至50mL试管4℃条件下保存待用，标记为nPGA。

称取1.9704g的2-MeIM溶于40mL蒸馏水中(浓度为600mmol)，称取0.2722g的Zn(OAC)₂.2H₂O溶于4mL蒸馏水中(浓度为310mmol)。将Zn²⁺溶液至于25℃水浴的磁力搅拌的三口烧瓶中，取5mL nPGA加入到2-MeIM溶液中，混匀后逐滴加入到Zn²⁺溶液中，780r/min磁力搅拌，25℃恒温水浴30min。离心9min，转速为7000r/min，将沉淀用PBS洗一次。所得产品即为仿生矿化纳米生物催化剂，于4℃下保存待用。所制备的仿生矿化纳米生物催化剂，制备过程中将酶分子事先荧光标记后制备所得催化剂进行激光共聚焦显微镜表征、扫描电镜和透射电镜表征与实施例1相似，可以看到微囊被成功固定于MOFs材料中，晶体粒子较为完整且晶型较好，存在介孔便于底物和酶分子的接触以及产物的扩散传质。利于催化反应的进行。

用其催化青霉素G钾盐分解反应(所得催化剂活性测定方法：取一定质量的所得催化剂置于1mL pH 7.0的PBS中，在37℃水浴锅中预热5min后，加入1mL 4％的青霉素G钾盐溶液，磁搅反应3min后，取出1mL反应液与3mL pH 2.5的醋酸缓冲液和1mL PDAB溶液避光显色10min，单层滤膜过滤后，用紫外分光光度计415nm下测其OD值。根据OD值对比产物的标准曲线，可知产物生成量。绝对酶活定义：在上述反应条件下，每1min催化生成1μmol产物所需催化剂的质量定义为1U。)通过分光光度计测量产物的生成量，可知活性为950U/g酶蛋白。重复使用10次后保留初始酶活的90％，具有了较高的重复使用性能；同时55℃下处理3h仍能保持初始酶活的89％，而游离酶在处理15min时已完全失活，固定化酶的热稳定性大幅度提升，增大了酶的应用可能，大幅度较低工业成本，较实施例5也有所提升。

本发明未尽事宜为公知技术。