一种亲水树枝和C18修饰的磁性石墨烯材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及亲水的树枝状分子和C18长链修饰的磁性石墨烯材料及其制备方法和在蛋白富集中的应用。

背景技术：

生命科学随着基因组测序计划的完成实现了巨大的进展，同时也进入了后基因组时代，而蛋白质组学也随之成为后基因组时代的研究前沿和热点领域。蛋白质是生命功能的执行者，也是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐述生命在生理或病理下的变化机制。近年来，蛋白质的分离和鉴定成为蛋白质组学中非常重要的一个部分。以液相色谱和生物质谱为技术手段的一系列研究手段逐渐被运用到蛋白质的分离和鉴定中。然而也遇到了一些挑战。比如有很多疾病相关的蛋白，它们在生物样品中存在的丰度很低，直接对其进行色谱和质谱的鉴定很困难，因而，去寻找合适而快捷的富集方法在蛋白质的鉴定中显的尤为重要。

石墨烯从发现以来由于它大的比表面积、表面富余的电子以及可修饰等特点得到了大量研究者的关注，而在生物分析研究领域，越来越多的以石墨烯为基底的材料也应运而生，广泛地运用到分离和富集的目标中。同时，C18长链超强的疏水作用也被运用到低丰度肽段和蛋白的富集中。近年来，一种亲水的聚酰胺-胺型树枝状分子（PAMAM）由于其表面大量的官能团和超强的亲水作用引起了研究者的关注。

在众多蛋白中，虽然大多数蛋白为疏水蛋白，但是也不乏大多亲水的糖蛋白在生物体内也发挥着重要的作用，据我们所知，尚未有研究表明一种材料同时结合亲水和疏水的性能而运用于蛋白的富集中。结合这一目标，本发明设计了一种利用磁性石墨烯材料为基底，在其表面接枝一种亲水的树枝状高分子PAMAM和C18的长链，从而达到分离和富集不同种蛋白的方法。这种方法成功的提高了蛋白的富集效率，对于蛋白的普适性很强，同时也有着很低的检测限。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种操作简便，样品损失率低，以亲疏水富集为机理，高效率低检测限的蛋白富集方法。

本发明提出的蛋白富集方法，是一种基于树枝状分子和C18长链修饰的磁性石墨烯材料对于蛋白富集方法。

本发明首先以磁性石墨烯为基底，在其表面包覆一层易于修饰的无孔二氧化硅，然后通过氨基和C18硅烷化试剂，在其表面修饰上氨基和C18长链，最后通过戊二醛交联法将一种亲水的树枝状分子聚酰胺-胺（PAMAM）接枝在氨基表面，得到亲疏水的磁性材料。该新型磁性材料拥有较大的比表面积，亲疏水相间的性能，用于蛋白富集，可完成对不同种蛋白的富集。

本发明提出的树枝状分子和C18长链修饰的磁性石墨烯材料的制备方法，具体步骤如下：

（1）将400-600 mg石墨烯分散到50-70 mL浓硝酸中，50-70 ℃水浴回流6-10小时；

（2）将步骤（1）所得产物进行离心、分离，用去离子水清洗至溶液为中性；

（3）将步骤（2）所得产物在40-60 ℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；

（4）将400-500 mg FeCl₃•6H₂O 溶于40-60 mL乙二醇中，搅拌得到黄色透明溶液；

（5）将步骤（3）所得产物分散在步骤（4）所得溶液中，超声1.0-2.0小时，步骤（3）所得产物与步骤（4）所得溶液比例为：（150-200 mg）:（40-60 mL）；

（6）超声搅拌情况下，将柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇（20000）加入到步骤（5）所得混合溶液中，充分搅拌1.0-1.5小时，其中柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇（20000）配比为（150-180 mg）：（1.5-2.0 g）:（1.0-1.5 g）；

（7）将步骤（6）所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220 ℃下加热8-10小时；

（8）将步骤（7）中高压反应釜冷却至室温，磁性分离产物，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料，40-60 ℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，记为magG；

（9）将步骤（8）所得产物修饰上无孔的二氧化硅，记为magG@SiO₂；

（10）将步骤（9）所得产物修饰上氨基和C18长链，记为magG@SiO₂@-NH₂/C18；

（11）将步骤（10）所得产物修饰上高分子的聚酰胺-胺（PAMAM），记为magG@SiO₂@PAMAM /C18。

本发明步骤（9）中，二氧化硅修饰磁性石墨烯的步骤具体如下：

（9.1）将200-250 mg的magG材料分散在100-150 mL异丙醇中，超声10-15分钟，之后加入超纯水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS），其中超纯水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS）的配比为10-15 mL: 1-2 mL: 1-1.5mL；

（9.2）将步骤（9.1）所得溶液超声混合10-15分钟，在30-35度条件下机械搅拌10-11h充分反应；

（9.3）通过磁性分离，将步骤（9.2）所得分析物经过水洗、乙醇洗到上清液澄清为止，以除去表面杂质；

（9.4）将步骤（9.3）所得产物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂材料。

本发明步骤（10）中，氨基和C18修饰磁性石墨烯的步骤具体如下：

（10.1）将200-250 magG@SiO₂材料分散在50-100 mL异丙醇中，超声10-15分钟，之后加入氨基硅烷化试剂（APTES）和碳十八硅烷化试剂（C18），二者的比例为1-2 mL: 1-2 mL；

（10.2）将步骤（10.1）所得溶液超声混合10-15分钟，在60-65度条件下机械搅拌10-11h充分反应；

（10.3）通过磁性分离，将步骤（10.2）所得分析物经过水洗、乙醇洗；

（10.4）将步骤（10.3）所得产物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@-NH₂/C18材料。

本发明步骤（11）中，PAMAM修饰的步骤具体如下：

（11.1）将100-150 magG@SiO₂@-NH₂/C18材料分散在20-30 mL 5%戊二醛溶液中，活化2-2.5 h；

（11.2）将步骤（11.1）所得溶液用无水甲醇洗3-4遍，加入20-25 mL 甲醇（其中包含50-55μL PAMAM 溶液），常温反应3-4 h；

（11.3）通过磁性分离，将步骤（11.2）所得上清液去除，加入20-30 mL氰基硼氢化钠的甲醇溶液（10-15 mg/mL）；反应2-2.5 h；

（11.4）通过磁性分离，将步骤（11.3）所得分析物经过甲醇洗、水洗、乙醇洗；

（11.4）将步骤（10.3）所得产物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@PAMAM/C18材料。

本发明把上述制备的树枝状分子和C18长链修饰的磁性石墨烯材料用于蛋白富集，具体操作步骤如下：

取 100-200 µg magG@SiO2@PAMAM/C18，用超纯水洗3-4遍。加入超纯水和适量的蛋白混合物，使总体积为95-110 µL；在20-30℃下富集20 min-30 min；磁性分离去除上清液，而后超纯水清洗2-3次，最后用洗脱液（80%-85%乙腈和0.1-0.2%TFA 溶液），在30-37℃下洗脱20-25 min，将富集到的蛋白洗脱下来，洗脱液进行HPLC和MALDI-TOF MS分析检测。

本发明提出的基于树枝状分子和C18长链修饰的磁性石墨烯材料对蛋白富集方法，在标准蛋白的富集中得到了很好的效果。

如图2所示，通过本发明方法，在对标准的四种蛋白（牛血清白蛋白：BSA，肌红蛋白：MYO，转铁蛋白：transferrin和溶菌酶：LYS）富集中，经过HPLC分析有较高的回收率，图3中它对于BSA和MYO蛋白的富集检测限达到1ng/μL，这些结果都说明我们的材料在对蛋白的富集中有非常高的效率，由此也可以证明这种材料在以后的蛋白质组学研究中有很好的应用前景。

附图说明

图1 magG@SiO2@PAMAM/C18材料的合成和富集流程图。

图2 magG@SiO₂@PAMAM/C18的电镜表征图。其中，(a)magG，(b)magG@SiO₂，(c)magG@SiO₂@PAMAM/C18。

图3 magG@SiO2@PAMAM/C18富集四种标准蛋白的HPLC色谱图。

图4 magG@SiO2@PAMAM/C18富集BSA和MYO检测限的MALDI-TOF 质谱图。其中，(a)BSA富集前, (b)BSA富集后，(c)MYO富集前, (d)MYO富集后。

具体实施方式

实施例1：magG@SiO₂@PAMAM/C18材料合成

（1）磁性石墨烯（magG）的合成：将400-600 mg石墨烯分散到50-70 mL浓硝酸中，50-70 ℃水浴回流6-10小时；所得产物进行离心、分离，用去离子水清洗至溶液为中性后在40-60 ℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；然后将400-500 mg FeCl₃•6H2O 溶于40-60 mL乙二醇中，搅拌得到黄色透明溶液；将上一步中的酸化石墨烯溶解在所得黄色溶液中，超声1.0-2.0比例为：150-200 mg：40-60 mL；接着在超声搅拌情况下，将柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇（20000）加入，充分搅拌1.0-1.5小时，其中，柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇（20000）配比为：（150-180 mg）：（1.5-2.0 g）：（1.0-1.5 g）；将混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220 ℃下加热8-10小时；反应结束后将反应釜冷却至室温，磁性分离产物，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料，40-60 ℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料(记为magG)；

（2）magG@SiO₂的合成，将（1）中200-250 mg的magG材料分散在100-150 mL异丙醇中，超声10-15分钟，之后加入超纯水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS），其中超纯水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS）的配比为10-15 mL: 1-2 mL: 1-1.5mL；所得溶液超声混合10-15分钟，在30-35度条件下机械搅拌10-11h充分反应。通过磁性分离后，所得分析物经过水洗、乙醇洗到上清液澄清为止，以除去表面杂质；最后产物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂材料；

（3）magG@SiO₂@-NH₂/C18的合成：将（2）中200-250 magG@SiO₂材料分散在50-100 mL异丙醇中，超声10-15分钟，之后加入氨基硅烷化试剂（APTES）和碳十八硅烷化试剂（C18），二者的比例为1-2 mL: 1-2 mL；所得溶液超声混合10-15分钟，在60-65度条件下机械搅拌10-11h充分反应；通过磁性分离，将所得分析物经过水洗、乙醇洗；最后所得产物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@-NH₂/C18材料；

（4）magG@SiO₂@PAMAM/C18的合成：将（3）中100-150 magG@SiO₂@-NH₂/C18材料分散在20-30 mL 5%戊二醛溶液中，活化2-2.5 h; 所得溶液用无水甲醇洗3-4遍，加入20-25 mL 甲醇（其中包含50-55μL PAMAM 溶液），常温反应3-4 h；通过磁性分离，将所得上清液去除，加入20-30 mL氰基硼氢化钠的甲醇溶液（10-15 mg/mL），反应2-2.5 h；通过磁性分离后，所得分析物经过甲醇洗、水洗、乙醇洗；最后所得产物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@PAMAM/C18材料。

实施例2：100-200 µg magG@SiO2@PAMAM/C18材料用于蛋白的富集

取 100-200 µg magG@SiO2@PAMAM/C18，用超纯水洗3-4遍。加入超纯水和适量的蛋白混合物，使总体积为95-110 µL；在20-30℃下富集20 min-30 min；磁性分离去除上清液，而后超纯水清洗2-3次，最后用洗脱液（80%-85%乙腈和0.1-0.2%TFA 溶液），在30-37℃下洗脱20-25 min，将富集到的蛋白洗脱下来，洗脱液进行HPLC和MALDI-TOF MS分析检测。