治疗心脑血管疾病的脑心清颗粒及其制备与有效成分含量测定方法

专利名称：治疗心脑血管疾病的脑心清颗粒及其制备与有效成分含量测定方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域。涉及一种用于心脑血管疾病的脑心清颗粒及其制备与有效成分含量测定方法，特别涉及以含有中药柿叶活性成分的提取物为原料，与适宜可药用的辅料一起制备而成的一种药物组合物口服制剂。
背景技术：
脑心清片是以中药柿叶为原料经提取加工而制成的一种口服制剂，其标准来源于卫生部药品标准WS3-B-3974-98。具有增加冠脉和脑动脉血流量，改善心、脑组织的供血供氧状态，增加红细胞电泳率作用，用于治疗冠心病心绞痛，脑动脉硬化，缺血性脑血管病，临床验证表明，疗效确切，不良反应较少，是临床常用药物。
但由于制备技术本身的原因，现有的脑心清片剂、胶囊等剂型，由于存在着溶散时限较长，溶出度较低，影响其吸收和生物利用度等指标，从而影响药效的发挥，甚至治疗效果。

发明内容
本发明的目的，在于补充现有用于治疗冠心病心绞痛，脑动脉硬化，缺血性脑血管病的口服药物制剂的不足，特别是不同于已有脑心清片剂、胶囊剂等剂型，提供一种分散度高，生物利用度好，且具有快速释药，快速吸收和快效显效的药物组合物口服制剂脑心清颗粒，包括无糖与有糖(含低糖)型颗粒。
本发明所涉及的脑心清颗粒，以中药柿叶为原料，与作为辅料的可药用添加剂一起制备而成。其成品每克颗粒相当于药材柿叶干浸膏25～500mg，所含乙酸乙酯浸出物为50mg～220mg。同时，进行了质量控制方法研究，结果为每克颗粒所含柿叶以槲皮素(C15H10O7)计，不得少于0.50mg。
本发明采用了以下技术方案，研究了脑心清颗粒制备工艺方案及其质量控制技术。
1、工艺流程(见说明书附图1)2、制备工艺研究(1)提取工艺路线的设计本品为颗粒剂，是由片剂改剂而成，为了使其改剂后的药效学不发生变化，在工艺研究时，其药材提取方法与片剂一样，即为水提醇沉法，所得浸膏加水溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯提取四次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，由于原技术对溶剂用量等工艺因素未确定，因此，此次工艺研究时对溶剂用量、干燥温度等工艺因素进行试验研究。
(2)药材的前处理药材经净选后，制成饮片。
(3)柿叶水提条件考察(3.1)吸水率考察称取柿叶三批，每批500g，分别加10倍量水，浸泡至透心，滤过，测得平均吸水率为405％。
(3.2)柿叶水提条件考察以提取次数，加水倍数，提取时间为考察因素，进行L9(34)正交试验，并以收膏率、槲皮素含量(％)为评价指标，筛选最佳工艺条件(收膏率、槲皮素含量权重系数分别为0.6，0.4)。
实验方法取柿叶药材9份，每份各500g，水提，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)的清膏。测收膏率和槲皮素含量。
收膏率按处方称取柿叶，水提，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度为1.12(60℃)的清膏。计算清膏与所提药材重量的百分比。
槲皮素的含量测定(HPLC)应用高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙醇(30～95％)-0.1％磷酸(1∶20～1∶50)为流动相，检测波长270nm，理论板数按槲皮素峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加乙醇(30％～90％)溶解并稀释成每1ml含槲皮素约40μg的溶液。
供试品溶液的制备 取本品约2g，精密称定，置具塞烧瓶中，加乙醇20ml，25％硫酸5ml，称定重量。水浴回流30min，冷却后称定重量，用乙醇补足减失的重量，混匀，滤过，再用滤膜过滤，即得。
样品测定法 分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，计算槲皮素含量(％)。结果见表1-2。
表1 因素水平表

表2 正交试验表

注以下收膏率、槲皮素含量(C15H10O7)二个评价指标，均采用综合评分法进行数据分析，收膏率、槲皮素含量(C15H10O7)权重系数分别为0.6，0.4。
收膏率评分＝清膏量/最大清膏量*0.6*100％槲皮素含量评分＝槲皮素含量/最大槲皮素含量*0.4*100％
综合评分＝收膏率评分+槲皮素含量评分由表2可知，A因素中(K1、K2)结果相差较大，A因素中(K2、K3)结果相差不大，考虑到大生产节约成本等因素，确定A2(提取2次)为最佳条件；C因素对结果影响不大，综合考虑后，确定最佳工艺条件为A2B3C3，由于C因素对结果影响不大，为了节约燃能和缩短工期，可以考虑第二次提取时间为1小时，即为柿叶加水煎煮二次，第一次2小时，加12倍量水，第二次1小时，加12倍量水。
(3)醇沉工艺条件考查以所加的乙醇浓度、静止时间、药液的含醇量。为考查因素，各取三个水平，采用L9(34)正交试验，并以槲皮素含量为评价指标，筛选醇沉条件。
试验方法取柿叶药材9份，每份各500g，按照上面正交筛选出的水提工艺，滤液浓缩至相对密度为1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达85％，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀用65％乙醇洗涤两次，收集洗涤液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，得浸膏(ρ＝1.35)。槲皮素含量测定方法同上，计算出槲皮素含量(mg/g)。结果见表3-4。
表3 因素水平表

表4 正交试验表


由表4可知，醇沉因素影响大小依次为A＞B＞C，由于B、C因素较小，考虑大生产实际情况，最佳工艺条件为A3B2C3。
(4)醋酸乙酯提取工艺条件考查以醋酸乙酯提取次数、药液的密度、药液的温度为考查因素，各取三个水平，采用L9(34)正交试验，并以提取物(干膏)为评价指标，筛选醋酸乙酯提取工艺条件。
试验方法取柿叶药材9份，每份各500g，按照上面正交筛选出的水提醇沉工艺，将所得浸膏加水溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯提取，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，稠膏低温干燥成干浸膏。以干浸膏为评价指标。
结果见表5-6。
表5 因素水平表

表6 正交试验表


由表6可知，醋酸乙酯提取影响大小依次为A＝B＞C，最佳工艺条件为A3B1C3。
(5)提取液的浓缩在中药生产中，减压浓缩所需时间短，又能防止有效成分长时间受热破坏，结合工厂实际生产条件，采用三效减压浓缩设备进行浓缩。将提取液浓缩成稠膏，测得其相对密度为1.12(60℃)。
(6)最佳工艺重复验证试验为了验证上述结果的准确性，以保证提取工艺的合理可行，按上述已确定的工艺条件安排3批验证试验，每批取干柿叶1000g，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.12(60℃)，加乙醇至含醇量达85％，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀用65％乙醇洗涤两次，收集洗涤液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏加水溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯提取四次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，稠膏低温干燥成干浸膏，试验结果见表7。
表7 柿叶浸膏粉提取工艺重复实验结果

从上述试验结果可以看出所筛选出来的工艺合理可行，稳定可靠，具有可操作性和重现性。
(7)柿叶中槲皮素含量转移率的计算取柿叶药材3份，每份1000g，按上面测槲皮素含量方法测定其药材中槲皮素含量(mg)，然后按正交筛选出的最佳工艺提取，测定其干膏量和干膏中槲皮素含量(mg)，柿叶中槲皮素含量的转移率如下表8 柿叶的转移率

3、颗粒制剂工艺研究本品为颗粒剂，由部颁中药脑心清片改剂而成。因此，我们对每次服用的药物量(干膏量)以原标准为参照，并以此推算出制颗粒时需要加入的辅料量辅料种类的确定常用制粒的辅料有糊精、淀粉、蔗糖等。本品是根据部颁中药脑心清片改剂而成，原标准选用淀粉为辅料。我公司将片剂改剂成颗粒后，根据颗粒的性质和患者的服用情况，将辅料改为了蔗糖和糊精。
辅料用量按上述计算方法可知每次服用的浸膏量为0.1g，按3g/袋设计，每袋中含有的干浸膏量为0.1g，辅料为2.9g，干浸膏∶辅料＝1∶29，由于提取物为醋酸乙酯提取出来的，为了使醋酸乙酯充分挥发，将其浸膏完全干燥，仍用淀粉浆作为粘合剂，其比例为干浸膏∶蔗糖∶糊精＝1∶25∶4。
制粒原料前述12.5.1.节“半成品制备工艺研究”所制得的干膏。
操作称取干膏0.1kg，取蔗糖和糊精分别为2.5kg、0.4kg置桶式预混机中，逐渐加入淀粉浆0.1kg混匀，制成松紧适度的软材，过14目筛制粒。用14目筛在操作上较16目筛容易，，粒度也较为均匀，因此采用14目筛湿法制粒。制粒中干浸膏∶蔗糖∶糊精混合比例的考察表9

由表9可见，干浸膏∶蔗糖∶糊精的比例1∶25∶4，乙醇浓度35％时制粒效果最好。
颗粒的干燥与整粒本品制粒后，在烘干过程中，用低温干燥，起始温度设定为40℃，然后在1小时之内缓慢升至60℃，干燥至颗粒的水分含量低于2.0％时，干燥完毕。
整粒为使颗粒大小均匀，保证剂量，便于分装，需进行整粒，本品用14目筛进行整粒，1好筛和5号筛筛选。
整粒后合格颗粒的收率约为94.2％。
颗粒的物理性质性状 本品为淡黄色至棕褐色颗粒；味甜，微苦。
堆密度 取颗粒15g，置于50ml量筒中，测定颗粒体积，计算堆密度。测定结果如下表10 颗粒堆密度测定

本品堆密度为0.46g/ml。
流动性采用漏斗法测定颗粒的流动性，计算休止角，测定结果如下表11 颗粒的流动性测定

本品的休止角为29.3°，颗粒的流动性较好，易于颗粒的分装。
临界相对湿度的测定本品为颗粒剂，颗粒在分装的过程中容易吸湿，影响产品的质量。因此须考察颗粒在分装过程中受环境的影响，尤其是湿度的影响，进行了吸湿性试验，测定临界相对湿度。取颗粒5份，置称量瓶中，精密称定，分别放入相对湿度为33％、42.8％、59.7％、75.3％、92.5％的环境中，于25℃恒温培养箱内放置48小时，取出测定其水分。以相对湿度为横坐标，水分为纵坐标，绘制吸湿平衡曲线(见图)，试验结果如下表12 临界相对湿度测定结果

脑心清颗粒吸湿曲线图见说明书附图2。
由测定结果可知，脑心清颗粒在不同的相对湿度的环境中，其吸湿量不同，在相对湿度小于60％以下的环境中颗粒的吸湿性不强，在此环境中分装不影响本品的水分。因此，本品分装时相对湿度应控制在60％以下。
本品装量由上述可知3g/袋，每次服用1-2袋，1日3次。
包装材料的确定由于本品的临界相对湿度较低，容易吸湿，因此应选择隔气、隔湿性强的复合膜袋，作为本品的包装材料。
4、质量控制与HPLC方法的研究采用薄层色谱法，对处方中含有的糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品进行了定性鉴别研究，对照品溶液和供试品溶液的制备按照原质量标准制备如下取本品约8g，加乙酸乙酯50ml，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2ml，作为供试品溶液。另取糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品各1mg，分别用乙酸乙酯1ml溶解，制成对照品溶液。
检测照薄层色谱法(附录VIB)试验，吸取上述四种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热半小时，放冷，喷以0.05％溴酚蓝乙醇溶液。发现在供试品色谱中，与对照品色谱相应位置上斑点不明显，故考虑是因为本品在改剂过程中辅料比例增加的原因，因此在供试品制备过程中又增加了乙酸乙酯提取过程，具体供试品制备如下取本品约8g，加乙酸乙酯50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水超声溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯液浓缩至约2ml，作为供试品溶液。
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和各对照溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热半小时，放冷，喷以0.05％溴酚蓝乙醇溶液。在供试品色谱中，在分别与各对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
其余条件不变，以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(2∶2∶1)为展开剂，展开，也可取得较好的分离效果。阴性无干扰。
砷盐检查依法(《中华人民共和国药典》2005年版一部附录IX F第一法古蔡氏法)对三批小试样品进行检查。
标准砷溶液的制备称取三氧化二砷0.132g，置1000ml量瓶中，加20％氢氧化钠溶液5ml溶解后，用适量的稀硫酸中和，再加稀硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。
临用前，精密量取贮备液10ml，置1000ml量瓶中，加稀硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml相当于1μg的As)。
仪器装置用药典规定的仪器，于导气管C中装入醋酸铅棉花60mg(装管高度为70mm)，再于旋塞D的顶端平面上放一片溴化汞试纸，盖上旋塞盖E并旋紧，即得。
标准砷斑的制备精密量取标准砷溶液2ml，置A瓶中，加盐酸5ml与水21ml，再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将已装妥的导气管C密塞于A瓶上，并将A瓶置30℃水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。
检查称取三批供试品各1g(每批两份)，置古蔡氏瓶中，各加水20ml使溶解，照标准砷斑的制备，自“再加碘化钾试液5ml”起，依法操作。将生成的三批样品的6个砷斑与标准砷斑(2ppm)比较，结果颜色更浅，说明三批供试品中砷含量均小于2ppm。按有关规定，不将此项检查列于正文标准。
微生物限度照微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录XIII C)试验，样品均符合规定。
表 颗粒剂通则检查结果表

结论实验样品制剂通则检查结果全部合格。
乙酸乙酯浸出物检查取本品三批小试样品各约10g(准确至0.01g)，用乙酸乙酯为溶剂，照醇溶性浸出物测定法测定。
检测对象选择原颗粒剂质量标准中并没有含量测定项，在本次研究中新增加了含量测定项。
本品是由柿叶经提取制成的颗粒剂，根据柿叶的药理文献资料可知，柿叶黄酮在心脑血管系统方面有较大的药理作用，故在增订含量测定项时我们优先考虑了柿叶黄酮类成分，而柿叶黄酮类成分中含有槲皮素，其含量测定方法研究很多，用的最广泛的是高效液相色谱法，此检测法准确度高、重现性好，是现代药物检测中常用的方法。因此，本品采用高效液相色谱法测定其槲皮素的含量。
含量测定方法学研究本次研究参照了其他制剂中含有槲皮素成分的含测方法(高效液相色谱法)，起草了测定本品中槲皮素含量的方法，并在测定中试产品的槲皮素含量基础上初步确定了本品中槲皮素的含量限度。
检测波长的确定取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，在200～400nm范围内用紫外仪扫描，结果发现槲皮素在270nm处有最大吸收，故将检测波长定为270nm。
色谱条件及系统适应性试验流动相的选择参考其他制剂的槲皮素含量测定的流动相，进行了流动相的筛选试验，最后选定流动相为甲醇-0.1％磷酸(1∶20～1∶50)；柱温40℃，流速1.0ml/min，同时空白辅料实验证明阴性样品无干扰(见图3～5)。
色谱柱的筛选本次研究对色谱柱进行了筛选，先后分别以KromasilC18柱(4.6×250mm，5μm)，Dikma diamonds C18(4.6×250mm 5μm)为分析柱进行分析，经过试验，发现以Kromasil C18柱(4.6×250mm，5μm)进行分析的分离效果最好，理论塔板数高。
对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品9.5mg，置25ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(0.38mg/ml)。精密吸取贮备液1ml，转移至10ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含槲皮素0.038mg的对照品溶液。
提取条件的考察参考其他含有槲皮素成分的制剂含量测定项下的供试品溶液的制备方法，我们选择以甲醇和25％的盐酸作为提取溶剂，并进行了提取方式和提取时间进行了考察。
提取方式的考察取本品各两份，每份约2g，精密称定，均置具塞烧瓶中，加甲醇20ml，25％盐酸5ml，称定重量。一份水浴回流30min，冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，再用0.45μm的滤膜过滤，即得供试品样1。
另一份用超声提取30min，冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，再用0.45μm的滤膜过滤，即得供试品样2。
精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液1、2各10μl注入高效液相色谱仪，测定，计算结果，回流提取与超声提取的结果比较见表3(图6～8)。
表3 不同提取方法样品中槲皮素含量

二种方法提取样品，结果差异较大，回流提取效果较好，故选用回流提取法。
提取时间的考察取本品三份，每份约2g，精密称定，均置具塞烧瓶中，加甲醇20ml，25％盐酸5ml，称定重量。一份水浴回流1小时，一份回流1.5小时，一份回流2小时，冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，再用0.45μm的滤膜过滤，即得供试品样3、4、5。
精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液3、4、5各10μl注入高效液相色谱仪，测定，计算结果，提取时间考察结果比较见表4(图9～12)。
表4 提取时间的考察试验

提取0.5小时后含量基本稳定，故选择提取时间为0.5小时。
线性关系考察及回归方程精密吸取槲皮素对照品贮备液(0.38mg/ml)0.5ml、2ml、4ml、5ml分别置10ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，浓度为0.019mg/ml、0.076mg/ml、0.152mg/ml、0.19mg/ml。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10μl，按上述色谱法条件测定峰面积，以峰面积和进样量计算回归方程，结果见表5。
表5 槲皮素进样量与峰面积线性关系

槲皮素线性关系图见说明书附图3。
槲皮素在0.19～1.9μg范围内具有良好的线性关系(见上图)。
精密度实验精密吸取上述对照品溶液(0.038mg/ml)10μl，重复进样5次，槲皮素对照品峰面积的RSD＜2％，结果见表6。
表6 精密度试验结果

重复性试验取本品平行6次试验，按正文方法进行含量测定，结果槲皮素含量平均值为1.0474mg/g，RSD为1.02％，详见表7。
表7 重复性试验结果

样品溶液稳定性试验取上述供试品溶液1，分别在第0、2、4、6、8小时进样，每次10μl，记录峰面积积分值，RSD为1.77％，表明样品溶液中槲皮素在8小时内测定有良好稳定性。
表8 样品溶液稳定性试验结果

回收率试验采用加样回收率法，精密称取已知含量本品9份各约1g，精密称定，置具塞烧瓶中，分别加入一定量对照品(精密称取槲皮素对照品17.4mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.174mg/ml，分别加入不同的量，见表9)，加甲醇20ml，25％盐酸5ml，称定重量。水浴回流30min，冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，再用0.45μm的滤膜过滤，即得。
精密吸取对照品溶液和各供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，测定，计算结果，以下式计算回收率，结果见表9

表9 回收率测定结果

结果表明，本法回收率较好。


图1工艺流程图2脑心清颗粒吸湿曲线3槲皮素线性关系图具体实施方式
实施例1取干柿叶，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，每次加12倍量水，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达85％，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀用65％乙醇洗涤两次，收集洗涤液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏加水溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯提取四次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，稠膏低温干燥成干浸膏，每33.4g干浸膏加蔗糖和糊精970g(蔗糖∶糊精＝25∶4)，混匀，用35％的乙醇适量，制成颗粒，低温干燥，制成1000g，即得。
实施例2如上法所制得柿叶乙酸乙酯提取物干浸膏150g，加入糊精2000g及适量甜叶菊甙矫味剂，混匀，用30％乙醇适量，制粒，低温干燥，整粒即得脑心清无糖型颗粒。
权利要求
1.一种用于心脑血管疾病的脑心清颗粒及其制备与有效成分含量测定方法。其特征为颗粒剂剂型，包括无糖型与有糖型(含低糖)型。所有辅料为淀粉糊精及矫味剂等。
2.如权利要求1所述的脑心清颗粒，其特征为由柿叶的乙酸乙酯提取物为活性有效成分制得的颗粒剂，每克颗粒所含乙酸乙酯提取物(或干浸膏)为25mg～220mg。
3.如权利要求1所述的脑心清颗粒，其特征在于所述药物提取物与所用辅料的混合比例可为1∶0.5～1∶9.5。
4.如权利要求1所述的脑心清颗粒制剂有效成分的含量测定方法，其特征在于采用HPLC方法进行，所测定结果为每克颗粒所含柿叶以槲皮素(C15H10O7)计，不得少于0.50mg。
全文摘要
本发明涉及的是柿叶提取物颗粒剂及其制备与有效成分含量测定方法。本发明目的，在于补充现有用于治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化与缺血性脑血管疾病的口服药物制剂的不足，提供一种生物利用度高、并且有快速释药、快速吸收、快速显效，携带服用方便，且在生产中无污染的脑心清颗粒剂，提高患者的顺应性。
文档编号G01N30/00GK1813859SQ20051002219
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者冀广沁, 陈家伟, 石万棋, 支春, 左治国, 李先楞, 万玲, 徐琨 申请人:四川国康药业有限公司