专利名称：磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸及制备方法
技术领域：
本发明属于用标记抗体与抗原免疫反应来测试抗原的试纸和制备方法。
背景技术：
磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine)属于磺胺类药物，是具有广谱抗菌活性的抗生素，作为抗菌剂应用于兽医临床以预防或治疗细菌性传染病，且其亚治疗浓度又作为畜禽的饲料药物添加剂应用于畜牧业生产，以控制某些动物性疾病、提高饲料的转化率和促进动物的生长发育。磺胺二甲基嘧啶是一种可疑致癌物，能诱发人的甲状腺癌，产生一定的耐药性，对磺胺二甲基嘧啶过敏的人会导致心悸、气短等不良反应。由此所导致的在动物源性食品中的残留问题受到广泛重视。目前，测定磺胺二甲基嘧啶的方法主要有高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫等方法，HPLC法要求有特殊的仪器设备和专业技术人员，且样品筛选量少、需要样品的前处理，因此其检测成本高、检测时间长，这些因素限制了HPLC法对磺胺二甲基嘧啶检测项目的开展，不能完全满足当前食品安全对磺胺二甲基嘧啶残留量检测的需要，而酶联免疫试剂主要依赖进口，检测成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供使用方法简便，省时省力省钱，灵敏度高的磺胺二甲基嘧啶检测试纸及试纸的制备方法。
本发明磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸包括固着于衬板7上的硝酸纤维素膜6，其特征是硝酸纤维素膜6表面由下向上分别地依次固着金标磺胺二甲基嘧啶单抗2、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4，构成复合层。
所述硝酸纤维素膜6上端与上吸水垫5串联；下端或通过金标磺胺二甲基嘧啶单抗2与下吸水垫1连接，或直接与下吸水垫1串联。
所述金标磺胺二甲基嘧啶单抗2、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3及抗鼠IgG抗体4的表面有不干胶纸。
抗鼠IgG抗体来自与磺胺二甲基嘧啶单抗相异的动物种属产生的对应结合能力。例如，单抗是抗磺胺二甲基嘧啶鼠IgG单抗，则抗鼠IgG抗体为羊或兔抗鼠IgG抗体。
磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸的制备方法，包括固着在衬板7上的硝酸纤维素膜6，其特征是(1)磺胺二甲基嘧啶与大分子蛋白结合成磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3免疫鼠细胞的克隆得到抗磺胺二甲基嘧啶单抗，(2)胶体金颗粒标记磺胺二甲基嘧啶单抗形成金标磺胺二甲基嘧啶单抗2，(3)磺胺二甲基嘧啶单抗免疫种属相异动物得到抗鼠IgG抗体4，(4)将胶体金标记磺胺二甲基嘧啶单抗2、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4间隔地顺序附着在硝酸纤维素膜6上，其中，以磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3为检测带，以抗鼠IgG抗体4为参照带。
磺胺二甲基嘧啶单抗由磺胺二甲基嘧啶偶联抗原免疫鼠细胞，以鼠腹水形式制备，抗体效价不低于15000，或有效抗体含量大于0.5mg/ml。
所述底板7中部固定硝酸纤维素膜6，下吸水垫1和上吸水垫5分别地贴于底板7两端与硝酸纤维素膜6串联；下吸水垫1或者与固定于硝酸纤维素膜6一端的金标磺胺二甲基嘧啶单抗2部分交叠。
所述下吸水垫1、金标磺胺二甲基嘧啶单抗2及上吸水垫5表面贴有不干胶纸。
磺胺二甲基嘧啶单抗由磺胺二甲基嘧啶偶联抗原免疫鼠细胞，以鼠腹水形式制备，抗体效价不低于15000。
本发明原理样液中的磺胺二甲基嘧啶由硝酸纤维素膜毛细管虹吸作用向膜上端移动，在金标单抗处，磺胺二甲基嘧啶与金标单抗结合形成复合物；当样液中磺胺二甲基嘧啶过量时，复合物漂移到二抗控制带被捕捉，检测带颜色不变；当磺胺二甲基嘧啶未达到检测标准时，金标单抗漂移到检测带与磺胺二甲基嘧啶偶联抗原结合，检测带显色。因此，检测带颜色随着样液中磺胺二甲基嘧啶含量大小变化。
本发明整个操作过程只须10分钟，简便、快速、经济、灵敏度可达到2ppb，对牛奶、血清、饲料、尿液、肉类和组织提取物等样品进行磺胺二甲基嘧啶残留量检测，能满足快速检测的要求。
图1为本发明示意图。
图2是本发明下吸水垫1与金标磺胺二甲基嘧啶单抗2部分交叠的侧视图。
图3是本发明下吸水垫1与硝酸纤维素膜6串联的侧视图。
具体实施例方式
一、磺胺二甲基嘧啶检测试纸正面由下至上依次为下吸水垫1、金标磺胺二甲基嘧啶单抗2、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3、抗鼠IgG抗体4、上吸水垫5，以及硝酸纤维素膜6、塑料衬板7。
下吸水垫1和固相金标单抗2表面以及上吸水垫5表面贴有彩色不干胶纸。
其中，以磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3作为检测带，以抗鼠IgG抗体4作为参照带。
膜条宽度不低于2.5m，且外观平整，材料附着牢固，液体移行速度不低于5mm/min。
二、磺胺二甲基嘧啶检测试纸的制备(1)将磺胺二甲基嘧啶与牛血清蛋白分子结合成磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3，用抗原3免疫鼠细胞的克隆以鼠腹水形式制备，获得磺胺二甲基嘧啶单抗，抗体效价为15000；用胶体金颗粒标记磺胺二甲基嘧啶单抗形成金标磺胺二甲基嘧啶单抗2；磺胺二甲基嘧啶单抗免疫羊得到羊抗鼠IgG抗体4。金标磺胺二甲基嘧啶单抗和磺胺二甲基嘧啶偶联抗原为标准量2ppb设置。
将金标磺胺二甲基嘧啶单抗2、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原3、羊抗鼠IgG抗体4间隔3-7mm顺序敷于底板7中部的的硝酸纤维素膜6上，与硝酸纤维素膜6表面形成复合层。
图2是将下吸水垫1粘贴于底板7靠金标磺胺二甲基嘧啶单抗2一端，并与硝酸纤维素膜6表面的金标磺胺二甲基嘧啶单抗2部分交叠；上吸水垫5粘贴于底板7靠参照带4一端，并与硝酸纤维素膜6一端交叠。
图3是将下吸水垫1粘贴于底板7靠金标磺胺二甲基嘧啶单抗2一端，并与硝酸纤维素膜6部分交叠；上吸水垫5粘贴同图2。
在下吸水垫1、金标磺胺二甲基嘧啶单抗2及上吸水垫5表面有不干胶纸。
(2)检测试纸的制备要求1、外观平整，材料附着牢固。
2、物理检查用动物阴性血清标本或生理盐水进行10次平行检测，1min时观察，液体移行速度应不低于5mm/min。
3、阴性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS0.0lmol/L，pH7.4)配制浓度为20ng/ml的磺胺甲基嘧啶溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制浓度为100ng/ml的磺胺嘧啶纯品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制浓度为100ng/ml的磺胺甲氧基嘧啶纯品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制浓度为100ng/ml的磺胺二甲氧基嘧啶纯品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制浓度为100ng/ml的磺胺吡啶纯品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。
4、阳性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制10、50、100ng/ml的磺胺二甲氧基嘧啶国家标准品溶液，分别进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，不得出现阴性。
5、最低检出量用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制浓度为0、1、2、5、10、20ng/ml的磺胺二甲基嘧啶国家标准品溶液，各浓度进行10次平行检测，反应时间在5min时观察结果，最低检出量应不高于2ng/ml。
6、再现性用磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/L，pH7.4)配制10ng/ml的磺胺二甲基嘧啶国家标准品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min时观察结果，反应结果应一致、显色度均一。
7、稳定性包装完好的试纸于37℃±0.5℃放置10天后，各项指标应符合以上1-6要求。
三、试纸使用(1)样品制备血清抽取待检动物血液，离心或静置后取透明上清夜使用；若血清有过度溶血现象，将血清用蒸馏水稀释一倍后再进行实验，否则试剂片红色太深，影响测试结果。
尿液用尿液直接进行测试，如浑浊，先离心取上清夜或蒸馏水1∶1稀释。
饲料取1g一磨碎的待测饲料加入10ml稀释液，其间每隔2min用力震荡；10min时，摇均后静置1min取上清夜100μl，用稀释液做10倍稀释后用试纸分析。
(2)操作及检测将试纸箭头端浸泡在待测样本中，不要超过下吸水垫。浸入30sec取出放平，10min读取结果。
阴性两条带都显色，且检测带颜色深于参照带颜色，说明样品中不含磺胺二甲基嘧啶。
两条带都显色，且检测带颜色与参照带颜色相同或接近，说明样品的磺胺二甲基嘧啶含量低于2ppb(2ng/ml)。
阳性两条带都显色，但检测带颜色浅于参照带颜色，说明检测样品中磺胺二甲基嘧啶含量超过2ppb(2ng/ml)。
检测带不显色，参照带显色，说明样品中的磺胺二甲基嘧啶含量高于5ppb(5ng/ml)。
检测结果如下表所示
上表均以ppb或ng/ml为检测量的单位。检测带＞、≈、＜、0是与参照带颜色比较。
权利要求
1.磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸，包括固着于衬板(7)上的硝酸纤维素膜(6)，其特征在于硝酸纤维素膜(6)表面由下向上分别地依次固着金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原(3)、抗鼠IgG抗体(4)，构成复合层。
2.根据权利要求1所述的磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸，其特征在于在硝酸纤维素膜(6)上端与上吸水垫(5)串联；下端或通过金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)与下吸水垫(1)连接，或直接与下吸水垫(1)串联。
3.根据权利要求1所述的磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸，其特征在于金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原(3)及抗鼠IgG抗体(4)的表面有不干胶纸。
4.磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸的制备方法，包括固着于衬板(7)上的硝酸纤维素膜(6)，其特征在于(1)磺胺二甲基嘧啶与动物大分子蛋白结合成磺胺二甲基嘧啶偶联抗原(3)免疫鼠细胞的克隆得到抗磺胺二甲基嘧啶单抗，(2)磺胺二甲基嘧啶单抗用胶体金颗粒标记形成金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)，(3)磺胺二甲基嘧啶单抗免疫异种动物得到抗鼠IgG抗体(4)，(4)将金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原(3)、抗鼠IgG抗体(4)分别地顺序附着在硝酸纤维素膜(6)上，其中，以磺胺二甲基嘧啶偶联抗原(3)作为检测带，以抗鼠IgG抗体(4)作为参照带。
5.根据权利要求4所述的磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸的制备方法，其特征在于下吸水垫(1)粘贴于衬板(7)下部，或与金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)部分交叠，或直接与硝酸纤维素膜(6)相连；而上吸水垫(5)粘贴于衬板(7)上部，与硝酸纤维素膜(6)一端交叠。
6.根据权利要求4所述的磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸的制备方法，其特征在于金标磺胺二甲基嘧啶单抗(2)、磺胺二甲基嘧啶偶联抗原(3)及抗鼠IgG抗体(4)的表面贴有不干胶纸。
全文摘要
磺胺二甲基嘧啶胶体金法检测试纸，属于用标记抗体与抗原免疫反应来测试待测物质的材料和方法。本发明目的是提供使用方法简便，省时省力省钱，灵敏度高的磺胺二甲基嘧啶检测试纸及制备方法。本发明用磺胺二甲基嘧啶偶联抗原、抗鼠IgG抗体、胶体金标记的磺胺二甲基嘧啶单抗和其它试剂固着在硝酸纤维素膜上制成，应用层析式一步竞争法的原理检测样品中的磺胺二甲基嘧啶残留量。本发明操作过程只须10分钟，灵敏度为2ppb，简便、经济，能满足对牛奶、血清、饲料、尿液、肉类和组织提取物等样品进行磺胺二甲基嘧啶残留快速检测的需求。
文档编号G01N33/544GK1818657SQ20061001073
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者马岚, 袁航, 葛长荣, 张曦 申请人:云南大学, 昆明云大生物技术有限公司, 马岚