专利名称：一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法
技术领域：
本发明属于分析化学、食品安全检测领域，具体的，涉及一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法。
背景技术：
磺胺类合成抗菌药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的抑制核酸合成广泛使用的预防性和刺激动物生长的抗菌药，其主要作用是通过抑制细菌繁殖达到抗菌的目的。磺胺二甲基嘧啶是磺胺类药物中的一种，具有性质稳定、广谱抗菌、口服易吸收且价格低廉的特点，被广泛应用畜牧生产和水产养殖中的动物疾病控制和治疗，是畜牧业生产中应用最广泛的磺胺类药物之一。经各种给药途径进入动物体内后，可残留在动物的肉、蛋和乳等组织及产品中，如果长期食用含有磺胺类药物残留的这些食品，使得药物通过食物链进入人体后，会破坏人的造血系统，导致血尿、结晶尿、肾脏损害等疾病，对人体健康造成危害。同时，磺胺类药物残留也是目前动物源性产品出口的主要监测指标之一，其超标严重影响着我国动物源性食品的出口贸易，所以研究磺胺类药物在动物源性食品中的残留是十分重要的。许多国家都规定了磺胺二甲基嘧啶及磺胺类药物在动物源性食品中的最高残留限量(MRL)。我国、加拿大、欧盟和美国规定动物源性食品中磺胺类药物总量和单个磺胺药物的最闻残留限量为100yg/kg。目前，检测动物源性食品中的磺胺类药物主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、酶联免疫法(ELISA)等方法。这些方法中存在仪器贵重、操作技能要求高、检测时间长耗时、所需费用高的问题。对动物源性食品中的磺胺二甲基嘧啶的检测是一个复杂的过程，由于动物源性食品基质复杂，样品的前处理过程非常重要。固相萃取(SPE)用于动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的净化富集，具有简单、方便、快捷的优点。但现有固相萃取柱都为一次性使用，价格较为昂贵，也存在着选择性差的严重不足。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，是一种分子印迹固相萃取结合表面拉曼增强技术用于检测动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的方法，制备分子印迹材料，填充固相萃取柱，用于动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的方便、高效地选择性净化富集，结合表面增强拉曼光谱技术进行灵敏、快速、方便定性定量检测。分子印迹技术是制备对特定分子具有专一性结合能力的技术，分子印迹材料具有很好的选择性，高度稳定性和长的使用寿命，已在分离提纯和传感器等方面显示出广阔的应用前景。分子印迹材料用于固相萃取填料，选择性高且几乎不存在杂质干扰。表面增强拉曼光谱技术具有检测时间短、检测灵敏度高、能直接原位分析、适合水溶液研究、所需样品量少等优点和特点，可提供分子水平的信息，在药剂分析、染料检测、生物传感分析、食品污染物检测等领域得到广泛应用。本发明利用分子印迹固相萃取柱来净化和富集动物源性食品中的磺胺二甲基嘧啶，除去干扰物和富集低浓度的待测物，并结合表面增强拉曼技术来实现快速、灵敏检测。有望用于食品安全检测中快速、灵敏检测动物源性兽药残留。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，所述检测方法的具体步骤为:
(I)利用本体聚合的方法，合成磺胺二甲基嘧啶的分子印迹材料:在玻璃容器中将模板分子磺胺二甲基嘧啶(SM2)、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、交联剂乙二醇二甲基双丙烯酸酯(EGDMA)按照摩尔比例为1:4-10:20-50混合均匀，一起加入到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声处理5-10分钟，通氮气除氧10分钟，密封，置于58-60°C水浴或油浴条件下，热引发聚合反应18-26小时，得到块状聚合物。将所得块状聚合物，通过研钵研磨，过200目和400目分样筛的，所得聚合物颗粒为35-75微米范围，用滤纸包裹置于索氏提取反应器，用甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液提取48-72小时，再用甲醇溶液提取8-16小时，颗粒于60°C条件干燥4小时，将干燥颗粒经丙酮沉降出去细小颗粒，所得产物45°C真空干燥8小时。得到磺胺二甲基嘧啶印迹材料。(2)用于分子印迹固相萃取柱的填料:称取步骤(I)合成的磺胺二甲基嘧啶印迹材料50-1000mg填充于l-6mL固相萃取空管,两端用20微米的固相萃取筛板封住。用10mL甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液淋洗分子印迹固相萃取柱，再用1-10 mL甲醇淋洗；干燥备用。(3)样品制备:取样品可食用部分，切碎，均质，于_18°C冷冻储存。(4)样品前处理及磺胺二甲基嘧啶提取:冷冻的样品平衡至室温后，准确称取步骤
(3)样品，加入无水硫酸钠、乙酸乙酯，漩涡振荡均质2分钟，4000转每分钟离心2分钟，收集乙酸乙酯溶液。再用乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯溶液，30°C温度下减压蒸馏至近干。加入10%甲醇溶解，加入正己烷，漩涡混合2分钟，转至离心管；重复溶解过程，合并混合液于离心管，漩涡2分钟，弃去正己烷，再加入正己烷重复操作一次。加入超纯水，待净化。(5)过分子印迹固相萃取柱净化:对步骤(2)的分子印迹固相萃取柱，依次用甲醇，超纯水，淋洗活化；将步骤(4)得到的待净化液加入分子印迹固相萃取柱；依次用超纯水和5%甲醇水溶液淋洗，抽干固相萃取柱；用甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液洗脱固相萃取柱；30°C条件下将洗脱液减压蒸馏至近干，用10%甲醇水溶液溶解定容。(6)标准溶液配制:准确称取磺胺二甲基嘧啶，先用HPLC级甲醇(终体积10%)溶解样品，再加超纯水(终体积90%)溶解配制成I mg/mL的标准储备液。由I mg/mL的标准储备液加超纯水逐级稀释得到不同梯度标准溶液。(7)表面增强拉曼检测:将壳层隔绝纳米粒子离心浓缩，所得浓缩壳层隔绝纳米粒子为拉曼增强粒子。准确移取步骤(6)配制磺胺二甲基嘧啶溶液，加入聚集剂，混匀，加入适量浓缩壳层隔绝纳米粒子，混匀，取适量混匀后溶液滴于承载疏水凹槽。用便携式拉曼光谱仪激光聚集，采集拉曼光谱，获得磺胺二甲基嘧啶的表面增强拉曼光谱图。对样品净化后溶液进行拉曼增强检测。
(8)对照和定性定量判断:由步骤(7)获得磺胺二甲基嘧啶的拉曼指纹图谱。对特征峰强度的变化和浓度做线性图，获得浓度与特征峰强度的线性方程。(9)检测实际样品净化浓缩液中磺胺二甲基嘧啶检测:按步骤(7)操作方法检测步骤(4)所得溶液中磺胺二甲基嘧啶的拉曼光谱。把特征峰强度与步骤(8)所得方程进行换算，得到检测溶液中磺胺二甲基嘧啶的浓度。通过换算得到动物源性食品中所含的磺胺二甲基嘧啶浓度。定性定量分析检测磺胺二甲基嘧啶的浓度。步骤(I)中所用致孔剂为乙腈或四氢呋喃,所用体积为8_15mL ;所用模板为磺胺二甲基嘧啶、功能单体为甲基丙烯酸、交联剂为乙二醇二甲基双丙烯酸酯、引发剂为偶氮二异丁腈；模板、功能单体、交联剂和引发剂摩尔比为1:4-6:20-30 ;过200目和400目分样筛的，所得聚合物颗粒为35-75微米范围。步骤(2)中填充分子印迹材料质量为50-1000 mg，所用固相萃取柱体积为I mL、3mL、6mL。步骤(4)中样品质量与无水硫酸钠质量比为I比0.5-1 ;样品质量与乙酸乙酯为Ig比3-5mL ;溶解旋蒸干燥样品的溶剂体积为l_3mL ;加入正己烷体积为2_4mL。步骤(5)，依次用1-1OmL甲醇，1-1OmL超纯水活化；用l_5mL超纯水和l_5mL 5%甲醇水溶液淋洗；用1-6 mL甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液洗脱固相萃取柱；用0.5mL-2mL10%甲醇水溶液溶解定容。步骤(6)中磺胺二甲基嘧啶先用甲醇助溶，再用超纯水定容；不同梯度标准溶液分别为为 20 ng/mL, 50ng/mL, 100 ng/mL, 200ng/mL, 500ng/mL, I ug/mL, 2ug/mL, 5 ug/mL, 10ug/mL, 100 ug/mL的标准溶液。步骤(7)中所用壳层隔绝纳米粒子为55纳米左右金纳米颗粒核外面包裹有针孔的二氧化硅壳层(由国家重大科学仪器设备开发专项-“等离激元增强拉曼光谱仪器研发与应用”项目组提供)；壳层隔绝纳米粒子离心浓缩通过离心机5500rpm离心15分钟或8500rpm离心5分钟或1.5mL壳层隔绝纳米粒子分装于1.5mL离心管静置沉降,弃去清液，浓缩倍数为10-50倍。步骤(7)中所用聚集剂为浓度为0.0lmol/L-lmol/L硝酸钾溶液或者硝酸镁溶液。步骤(7)中待检测液体积10-30UL，聚集剂体积为2_10uL，浓缩壳层隔绝纳米粒子体积为2-10uL，检测液体体积为20-40uL，承载凹槽为疏水凹孔。本发明的显著优点:本发明所合成的磺胺二甲基嘧啶分子印迹材料，对磺胺二甲基嘧啶具有良好的吸附性能，用于固相萃取填料，实现了动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的高效分离、富集和纯化。与常规固相萃取柱相比较具有富集、净化效率高，并且该分子印迹固相萃取柱可重复使用、成本低。结合表面增强拉曼光谱技术，利用便携式拉曼光谱仪实现对纯化富集后的磺胺二甲基嘧啶的快速、高灵敏检测。有望用于食品安全检测中快速、灵敏检测动物源性兽药残留。
图1为壳层隔绝纳米粒子透射电镜图；粒径约55纳米，二氧化硅壳层小于I纳米;
图2为分子印迹固相萃取柱不意图；图3为不同浓度磺胺二甲基嘧啶标准溶液的拉曼增强谱图浓度为O，50 ppb,100 ppb,200 ppb, 500 ppb, I ppm, 2 ppm, 5 ppm ;其中58201^1为磺胺二甲基卩密唳在表面增强拉曼中
的定量峰；
图4为50ppb磺胺二甲基嘧啶加标鱼肉提取液直接检测和固相萃取液拉曼增强检测图；说明了固相萃取柱可以分离和富集提取液中的磺胺二甲基嘧啶。图5为磺胺二甲基嘧啶分子印迹聚合物制备示意图。
具体实施例方式下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。以下结合附图给出本发明的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法的具体实施方式
，以对本发明进行详细的说明，但本发明的保护范围不限于以下的实施介绍。实施例1:磺胺二甲基嘧啶分子印迹聚合物的制备及固相萃取柱制备: 在玻璃容器中将模板分子磺胺二甲基嘧啶(SM2) 0.278 g (I mmol)、功能单体甲基丙烯酸(MAA) 0.35 mL (4.0 mmol)、交联剂乙二醇二甲基双丙烯酸酯(EGDMA) 3.85mL (20.0mmol)按照摩尔比例为1:4:20混合均匀，一起加入到致孔剂10 mL乙腈中，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN) 50 mg，超声处理10分钟，通氮气除氧10分钟，密封，置于60°C水浴条件下，热引发聚合反应24小时，得到块状聚合物。将所得块状聚合物，通过研钵研磨，过200目和400目分样筛，所得聚合物颗粒为35-75微米范围，用滤纸包裹置于索氏提取反应器，用甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液200mL提取72小时，再用甲醇溶液提取16小时，颗粒于60 1:条件干燥4小时，将干燥颗粒经丙酮沉降出去细小颗粒，所得产物45 1:真空干燥8小时。得到磺胺二甲基嘧啶印迹材料。称取合成的磺胺二甲基嘧啶印迹材料IOOmg填充于3 mL固相萃取空管，两端用20微米的固相萃取筛板封住。用10 mL甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液淋洗分子印迹固相萃取柱，再用f 10 mL甲醇淋洗；干燥备用。实施例2:鱼肉样品中磺胺二甲基嘧啶的提取与拉曼增强检测:
1、样品前处理及磺胺二甲基嘧啶提取
取鱼肉样品可食用部分，切碎，均质，于_18°C冷冻储存。检测时，冷冻的样品平衡至室温后,准确称取5 g样品,加入5 g无水硫酸钠、25 mL乙酸乙酯,镟润振荡均质2分钟,4000转每分钟离心2分钟，收集乙酸乙酯溶液。再用乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯溶液，30 1:温度下减压蒸馏至近干。加入10 %甲醇溶解，加入3 mL正己烷，漩涡混合2分钟，转至离心管；重复溶解过程，合并混合液于离心管，漩涡2分钟，弃去正己烷，再加入6 mL正己烷重复操作一次。加入超纯水，待净化。2、过分子印迹固相萃取柱净化
对分子印迹固相萃取柱，依次用3 mL甲醇，3 mL超纯水，淋洗活化；将得到的待净化液加入分子印迹固相萃取柱，流出液弃去；依次用3 mL超纯水和3 mL5%甲醇水溶液淋洗，抽干固相萃取柱；用5 mL甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液洗脱固相萃取柱；30°C条件下将洗脱液减压蒸馏至近干，用I mL 10%甲醇水溶液溶解定容(其分子印迹固相萃取过程参见图2)。
3、标准溶液配制
准确称取5.0 mg磺胺二甲基嘧啶，先用HPLC级甲醇(终体积10%)溶解样品，再加超纯水(终体积90%)溶解配制成I mg/mL的标准储备液。由I mg/mL的标准储备液加超纯水逐级稀释得到不同梯度标准溶液。不同梯度标准溶液分别为为20 ng/mL, 50ng/mL, 100 ng/mL, 200ng/mL, 500ng/mL, I ug/mL, 2ug/mL, 5 ug/mL, 10 ug/mL, 100 ug/mL 的标准溶液。4、表面增强拉曼检测
将壳层隔绝纳米粒子(其透射电镜图参见图1)离心浓缩，所得浓缩壳层隔绝纳米粒子为拉曼增强粒子。准确移取不同浓度磺胺二甲基嘧啶溶液，加入聚集剂，混匀，加入适量浓缩壳层隔绝纳米粒子，混匀，取适量混匀后溶液滴于承载疏水凹槽。用便携式拉曼光谱仪激光聚集，采集拉曼光谱，获得磺胺二甲基嘧啶的表面增强拉曼光谱图。对样品净化后溶液进行拉曼增强检测。壳层隔绝纳米粒子离心浓缩通过离心机5500rpm离心15分钟或8500rpm离心5分钟或1.5mL壳层隔绝纳米粒子分装于1.5mL离心管静置沉降，弃去清液，浓缩倍数为10-50倍。所用聚集剂为浓度为0.01mol/L-lmol/L硝酸钾溶液或者硝酸镁溶液。待检测液体积10-30uL，聚集剂体积为2-10uL，浓缩壳层隔绝纳米粒子体积为2_10uL，检测液体体积为20-40uL，承载凹槽为疏水凹孔或者铝片等载体。拉曼光谱采集积分时间为15s，功率60mW。实施例3:
一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，所述方法包括以下步骤:
(I)利用本体聚合的方法，合成磺胺二甲基嘧啶的分子印迹材料:在玻璃容器中将模板分子磺胺二甲基嘧啶(SM2)、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、交联剂乙二醇二甲基双丙烯酸酯(EGDMA)按照摩尔比例为1:4-10:20-50混合均匀，一起加入到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声处理10分钟，通氮气除氧10分钟，密封，置于60°C油浴条件下，热引发聚合反应20小时，得到块状聚合物；将所得块状聚合物，通过研磨，过200目和400目分样筛的，所得聚合物颗粒为35-75微米范围，用滤纸包裹置于索氏提取反应器，用甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液提取60小时，再用甲醇溶液提取9小时，颗粒于60°C条件干燥4小时，将干燥颗粒经丙酮沉降出去细小颗粒，所得产物45°C真空干燥8小时，得到磺胺二甲基嘧啶印迹材料；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1 ;(分子印迹聚合物制备示意图参见图5)
(2)用于分子印迹固相萃取柱的填料:
称取合成的磺胺二甲基卩密唳印迹材料200mg填充于6 mL固相萃取空管,两端用20微米的固相萃取筛板封住。用10 mL甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液淋洗分子印迹固相萃取柱，再用10 mL甲醇淋洗；干燥备用。(3)样品制备:取鱼肉样品可食用部分，切碎，均质，于_18°C冷冻储存；
(4)样品前处理及磺胺二甲基嘧啶提取:检测时，冷冻的样品平衡至室温后，准确称取5 g样品，加入5 g无水硫酸钠、25 mL乙酸乙酯,镟润振荡均质2分钟,4000转每分钟离心2分钟，收集乙酸乙酯溶液。再用乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯溶液，30 °C温度下减压蒸馏至近干。加入10 %甲醇溶解，加入3 mL正己烷，漩涡混合2分钟，转至离心管；重复溶解过程，合并混合液于离心管，漩涡2分钟，弃去正己烷，再加入6 mL正己烷重复操作一次。加入超纯水,待净化。
(5)过分子印迹固相萃取柱净化:对步骤(2)的分子印迹固相萃取柱，依次用甲醇，超纯水，淋洗活化；将步骤(4)得到的待净化液加入分子印迹固相萃取柱；依次用超纯水和5%甲醇水溶液淋洗，抽干固相萃取柱；用甲醇-乙酸混合液洗脱固相萃取柱；30°C条件下将洗脱液减压蒸馏至近干，用10%甲醇水溶液溶解定容；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1 ;(分子印迹固相萃取过程参见图2)
(6)标准溶液配制:准确称取磺胺二甲基嘧啶，先用HPLC级甲醇溶解样品，再加超纯水溶解配制成I mg/mL的标准储备液；由I mg/mL的标准储备液加超纯水逐级稀释得到不同梯度标准溶液；
(7)表面增强拉曼检测:将壳层隔绝纳米粒子离心浓缩，所得浓缩壳层隔绝纳米粒子为拉曼增强粒子；准确移取步骤(6)配制的磺胺二甲基嘧啶溶液，加入聚集剂，混匀，加入适量浓缩壳层隔绝纳米粒子，混匀，取适量混匀后溶液滴于承载疏水凹槽；用便携式拉曼光谱仪激光聚集，采集拉曼光谱，获得磺胺二甲基嘧啶的表面增强拉曼光谱图；对样品净化后溶液进行拉曼增强检测；(不同浓度磺胺二甲基嘧啶溶液的表面增强拉曼光谱图参见图3)
(8)对照和定性定量判断:由步骤(7)获得的磺胺二甲基嘧啶的拉曼指纹图谱，对特征峰强度的变化和浓度做线性图，获得浓度与特征峰强度的线性方程；
(9)检测实际样品净化浓缩液中磺胺二甲基嘧啶检测:按步骤(7)操作方法检测步骤
(4)所得溶液中磺胺二甲基嘧啶的拉曼光谱，把特征峰强度与步骤(8)所得方程进行换算，得到检测溶液中磺胺二甲基嘧啶的浓度，通过换算得到动物源性食品中所含的磺胺二甲基嘧啶浓度，定性定量分析检测磺胺二甲基嘧啶的浓度。步骤(I)中所用致孔剂为四氢呋喃,所用体积为15mL ;所用模板为磺胺二甲基嘧啶、功能单体为甲基丙烯酸、交联剂为乙二醇二甲基双丙烯酸酯、引发剂为偶氮二异丁腈；模板、功能单体、交联剂和引发剂摩尔比为1:4-6:20-30 ;过200目和400目分样筛的，所得聚合物颗粒为35-75微米范围。步骤(4)中样品质量与无水硫酸钠质量比为1:1 ;样品质量与乙酸乙酯为I g:5mL ;溶解旋蒸干燥样品的溶剂体积为3mL ;加入正己烷体积为4mL。步骤(5),依次用IOmL甲醇，IOmL超纯水活化；用5mL超纯水和5mL 5%甲醇水溶液淋洗；用6 mL甲醇-乙酸混合液洗脱固相萃取柱；用2mL10%甲醇水溶液溶解定容；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1。步骤(6)中磺胺二甲基嘧啶先用甲醇助溶，再用超纯水定容；不同梯度标准溶液分别为 20 ng/mL, 50ng/mL, 100 ng/mL, 200ng/mL, 500ng/mL, I ug/mL, 2ug/mL, 5 ug/mL, 10ug/mL, 100 ug/mL的标准溶液。步骤(7)中所用壳层隔绝纳米粒子为55纳米金纳米颗粒核外面包裹I纳米的有针孔的二氧化硅壳层；壳层隔绝纳米粒子离心浓缩通过1.5mL壳层隔绝纳米粒子分装于
1.5mL离心管静置沉降，弃去清液，浓缩倍数为40倍。步骤(7)中所用聚集剂为浓度为0.06mol/L硝酸镁溶液。步骤(7)中待检测液体积30uL，聚集剂体积为10uL，浓缩壳层隔绝纳米粒子体积为10uL，检测液体体积为40uL，承载凹槽为疏水凹孔。拉曼光谱采集积分时间为15s，功率60mW。(5g鱼肉加标250ng磺胺二甲基嘧啶后经样品处理和分子印迹固相萃取分离富集后，结合拉曼增强光谱检测的光谱图参见图4)。
权利要求
1.一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (I)利用本体聚合的方法，合成磺胺二甲基嘧啶的分子印迹材料:在玻璃容器中将模板分子磺胺二甲基嘧啶(SM2)、功能单体甲基丙烯酸(MAA)、交联剂乙二醇二甲基双丙烯酸酯(EGDMA)按照摩尔比例为1:4-10:20-50混合均匀，一起加入到致孔剂中，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超声处理5-10分钟，通氮气除氧10分钟，密封，置于58-60°C水浴或油浴条件下，热引发聚合反应18-26小时，得到块状聚合物；将所得块状聚合物，通过研磨，过200目和400目分样筛的，所得聚合物颗粒为35-75微米范围，用滤纸包裹置于索氏提取反应器，用甲醇-乙酸(9/1，ν/ν)混合液提取48-72小时，再用甲醇溶液提取8-16小时，颗粒于60°C条件干燥4小时，将干燥颗粒经丙酮沉降出去细小颗粒，所得产物45°C真空干燥8小时，得到磺胺二甲基嘧啶印迹材料；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1 ； (2)用于分子印迹固相萃取柱的填料:称取步骤(I)合成的磺胺二甲基嘧啶印迹材料填充固相萃取空管，两端用20微米的固相萃取筛板封住，用10 mL甲醇-乙酸混合液淋洗分子印迹固相萃取柱，再用10 mL甲醇淋洗；干燥备用；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1 ; (3)样品制备:取样品可食用部分，切碎，均质，于_18°C冷冻储存； (4)样品前处理及磺胺二甲基嘧啶提取:准确称取步骤(3)样品，加入无水硫酸钠、乙酸乙酯，漩涡振荡均质2分钟，4000rpm/min，离心2分钟，收集乙酸乙酯溶液；再用乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯溶液，30°C温度下减压蒸馏至近干，加入10%甲醇溶解，加入正己烷，漩涡混合2分钟，转至离心管；重复溶解过程，合并混合液于离心管，漩涡2分钟，弃去正己烷，再加入正己烷重复操作一次；加入超纯水，待净化； (5)过分子印迹固相萃取柱净化:对步骤(2)的分子印迹固相萃取柱，依次用甲醇，超纯水，淋洗活化；将步骤(4)得到的`待净化液加入分子印迹固相萃取柱；依次用超纯水和5%甲醇水溶液淋洗，抽干固相萃取柱；用甲醇-乙酸混合液洗脱固相萃取柱；30°C条件下将洗脱液减压蒸馏至近干，用10%甲醇水溶液溶解定容；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1 ； (6)标准溶液配制:准确称取磺胺二甲基嘧啶，先用HPLC级甲醇溶解样品，再加超纯水溶解配制成I mg/mL的标准储备液；由I mg/mL的标准储备液加超纯水逐级稀释得到不同梯度标准溶液； (7)表面增强拉曼检测:将壳层隔绝纳米粒子离心浓缩，所得浓缩壳层隔绝纳米粒子为拉曼增强粒子；准确移取步骤(6)配制的磺胺二甲基嘧啶溶液，加入聚集剂，混匀，加入适量浓缩壳层隔绝纳米粒子，混匀，取适量混匀后溶液滴于承载疏水凹槽；用便携式拉曼光谱仪激光聚集，采集拉曼光谱，获得磺胺二甲基嘧啶的表面增强拉曼光谱图；对样品净化后溶液进行拉曼增强检测； (8)对照和定性定量判断:由步骤(7)获得的磺胺二甲基嘧啶的拉曼指纹图谱，对特征峰强度的变化和浓度做线性图，获得浓度与特征峰强度的线性方程； (9)检测实际样品净化浓缩液中磺胺二甲基嘧啶检测:按步骤(7)操作方法检测步骤(4)所得溶液中磺胺二甲基嘧啶的拉曼光谱，把特征峰强度与步骤(8)所得方程进行换算，得到检测溶液中磺胺二甲基嘧啶的浓度，通过换算得到动物源性食品中所含的磺胺二甲基嘧啶浓度，定性定量分析检测磺胺二甲基嘧啶的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(I)中所用致孔剂为乙腈或四氢呋喃，所用体积为8-15mL ;所用模板为磺胺二甲基嘧啶、功能单体为甲基丙烯酸、交联剂为乙二醇二甲基双丙烯酸酯、引发剂为偶氮二异丁腈；模板、功能单体、交联剂和引发剂摩尔比为1:4-6:20-30 ;过200目和400目分样筛的，所得聚合物颗粒为35-75微米范围。
3.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(2)中填充分子印迹材料质量为50-1000 mg，所用固相萃取柱体积为I mL、3 mL或6mL。
4.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(4)中样品质量与无水硫酸钠质量比为1:0.5-1 ;样品质量与乙酸乙酯为I g:3-5mL ;溶解旋蒸干燥样品的溶剂体积为l_3mL ;加入正己烷体积为2_4mL。
5.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(5)，依次用1-1OmL甲醇，1-1OmL超纯水活化；用l_5mL超纯水和l_5mL 5%甲醇水溶液淋洗；用1-6 mL甲醇-乙酸混合液洗脱固相萃取柱；用0.5mL-2mL10%甲醇水溶液溶解定容；所述甲醇-乙酸混合液，按体积比计，甲醇:乙酸=9:1。
6.根据权利要求1所述一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(6)中磺胺二甲基嘧啶先用甲醇助溶，再用超纯水定容；不同梯度标准溶液分别为为 20 ng/mL,50ng/mL,100 ng/mL,200ng/mL,500ng/mL, I ug/mL,2ug/mL, 5 ug/mL,10 ug/mL, 100 ug/mL的标准溶液。
7.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(7)中所用壳层隔绝纳米粒子为53-58纳米金纳米颗粒核外面包裹0.9-1.1纳米的有针孔的二氧化娃壳层；壳层隔绝`纳米粒子离心浓缩通过离心机5500rpm/min,离心15分钟或8500rpm/min,离心5分钟或1.5mL壳层隔绝纳米粒子分装于1.5mL离心管静置沉降，弃去清液，浓缩倍数为10-50倍。
8.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于,步骤(7)中所用聚集剂为浓度为0.01mol/L-lmol/L硝酸钾溶液或硝酸镁溶液。
9.根据权利要求1所述的一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，其特征在于，步骤(7)中待检测液体积10-30UL，聚集剂体积为2-10uL，浓缩壳层隔绝纳米粒子体积为2-lOuL，检测液体体积为20-40uL，承载凹槽为疏水凹孔。
全文摘要
本发明提供了一种动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的检测方法，该检测的步骤为合成分子印迹材料；实际样品制备；用乙酸乙酯将磺胺二甲基嘧啶从水产品中提取；对提取液进行旋转蒸发；重新溶解于甲醇水溶液；经分子印迹固相萃取柱净化富集；结合壳层隔绝纳米粒子拉曼增强光谱检测磺胺二甲基嘧啶。本方法的积极效果所合成分子印迹材料特异性强，用于固相萃取柱填料，可以从实际样品中分离富集待测目标分子；结合壳层隔绝纳米粒子进行拉曼增强检测磺胺二甲基嘧啶，检测灵敏度高、速度快、样品用量少、操作方便，可用于动物源性食品中磺胺二甲基嘧啶的快速检测，检测灵敏度可达50ppb。
文档编号G01N1/34GK103105387SQ201310031829
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者杨黄浩, 张晓龙, 宋良, 柯开美, 刘威, 田中群 申请人:福州大学