专利名称：一种检测磺胺二甲基嘧啶的试剂板的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶残留的试剂板的制备方法，具体涉及 一种检测磺胺二甲基嘧啶的免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。
背景技术：
磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine)由乙酰丙酮直接与磺胺脒缩合制得，适用于 治疗溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌等感染疾病，用作饲料添加剂，可防治葡萄球菌 及溶血性链球菌等的感染。由于其药效持久显著，在蜜蜂饲养中常用磺胺类药物进行疾病 防治。然而不合理使用，易使磺胺二甲基嘧啶在蜂蜜中残留，药物通过食物链进入人体 后会导致血尿、结晶尿、肾脏损害等疾病，对人体健康健康造成危害，同时磺胺二甲基嘧啶 在蜂蜜中的残留也给蜂蜜贸易造成障碍。许多国家都规定了磺胺二甲基嘧啶及磺胺类药物在蜂蜜中的最高残留限量 (MRL)。我国及欧盟均规定动物性食品中总磺胺以及单个磺胺药物的MRL为lOOppb。目前，对于磺胺二甲基嘧啶残留的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理 化分析法，如HPLC及LC-MS，具有特异性好、准确率高的特点，是各大检测机构对检测样本 进行确证的首选方法，但存在对设备、环境、操作技能等要求，所需费用高，不利于大规模样 本筛选，因而不适合广大基层部门。免疫分析法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，具有检测量 大，操作相对简单等优点，越来越多地被用于动物性食品中抗生素残留的检测，但是ELISA 法整个操作时间仍需要l_2h，且需用到昂贵的特殊仪器设备酶标仪，具有一定局限性。食品安全关系国计民生，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短， 适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，简便快速，生产成本低的磺胺二 甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。本发明试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、 胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有l_2mm的重叠以保证层析作用从样 品垫到吸水垫部位的顺利进行。本发明试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部 分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶金结合垫，由聚酯膜制成，其上有 磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体与胶体金颗粒 的结合物。为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。
硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，将反应结果 以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。本发明试剂板具有如下有益效果(1)特异性好。本发明试剂板对磺胺二甲基嘧啶的交叉反应率为100%，对如磺胺 嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶等抗生素的交叉反应率均低于1%。可见，本发明试 剂板对磺胺二甲基嘧啶反应具有高度专一性。(2)灵敏度高。本发明试剂板对原蜜、浓缩蜜中磺胺二甲基嘧啶的检出限为 lOppb，符合国家限量要求。(3)操作简单快捷。本发明试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中， 滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴 样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的颜色深浅读取结 果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。(4)成本低，易推广。本发明试剂板生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉，投资 少，收效快。
图1为磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板背衬结构示意图，其中1为样 品垫，2为胶金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为不干胶， 8为PVC底板。图2为磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔， C为控制区，T为检测区。图3为磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控 制区，T为检测区。具体实施方法本发明试剂板的制备包括磺胺二甲基嘧啶-载体蛋白偶联物的制备，抗磺胺二甲 基嘧啶单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体 的制备和磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板的组装。1.磺胺二甲基嘧啶与载体蛋白的偶联采用重氮法将磺胺二甲基嘧啶与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原。称取 IOmg磺胺二甲基嘧啶溶于IOmL 12. 5mol/L的H2S04，将20mL 20 %的NaNO3溶液缓慢滴入 上述溶液中，4°C下反应lOmin。再在得到的混合溶液中加入2mL溶有IOOmg牛血清蛋白 (BSA)的碳酸钠缓冲溶液(pH 10.0)，4°C下反应过夜，生理盐水透析72h，制得的磺胺二甲 基嘧啶-BSA载体蛋白偶联物于_20°C冻存备用。卵清蛋白(OVA)替代BSA，同同样方法制备磺胺二甲基嘧啶-OVA偶联物。2.抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的磺胺二甲基嘧啶-BSA偶联物与等 体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不 完全佐剂替代完全佐剂进行腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 10的比例混合， 在50% PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C、5% C02培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初 筛选择10mg/L磺胺二甲基嘧啶-OVA偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后， 加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用磺胺二甲基嘧啶-OVA偶 联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3mol/L磺胺二甲基嘧啶 溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH 7.4)替 代磺胺二甲基嘧啶溶液作对照，其余步骤同上。若磺胺二甲基嘧啶阻断后的OD值降至对照 孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆 化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X IO5Hir1时停止换液，细胞 全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆 化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1% 柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8. O。边搅 拌边加入1. 5mg抗磺胺二甲基嘧啶单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min，弃上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 缓 冲液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶 解，用0. 22 μ m无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。5.磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的磺胺二甲基嘧啶-BSA偶联物及羊抗鼠IgG喷在 硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金 标记磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体包被在胶金结合垫上。检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素 膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板， 再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6.1样品制备取蜂蜜3mL加入15mL刻度冷冻管中，再依次加入磺胺二甲基嘧啶A液和B液各 lmL，于60°C 80°C的热水中温热数分钟，溶解蜂蜜，振荡混勻。加入SmL乙酸乙酯，上下翻 转振荡5min后静置。用滴管转移5mL上层有机溶剂于5mL刻度冷冻管中，用65°C氮(空) 气吹干。在该5mL刻度冷冻管中滴加5滴磺胺二甲基嘧啶专用PBST缓冲液，充分溶解管内 壁上残留物，待检。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100 μ L)，
5加样后开始计时，结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性㈠T线显色比C线深或一样深，表明样品中磺胺二甲基嘧啶浓度低于 IOppb或无磺胺二甲基嘧啶残留。如图3. a所示。阳性(+) :T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中磺胺二甲基嘧啶浓度高于 IOppb ；T线比C线越浅，表明样品中磺胺二甲基嘧啶浓度越高。如图3. b所示。无效未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新试 剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求
一种检测磺胺二甲基嘧啶的试剂板的制备方法，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，试剂板背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1 2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
2.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于试剂板的硝酸纤维素膜上的胶体金结合 垫上包被有抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物，从样品垫到吸水垫方向上依次 喷有检测线和质控线，包被有磺胺二甲基嘧啶-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，将反应结果 以肉眼可见的颜色表征出来。
3.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于胶金结合垫上包被有抗磺胺二甲基嘧啶 单克隆抗体与胶体金结合物，胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于偶联磺胺二甲基嘧啶的载体蛋白可为牛 血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。
5.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于样品中的磺胺二甲基嘧啶含量超过试剂 板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；反之，当样品中 磺胺二甲基嘧啶含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相 近或偏深，判定为阴性。
6.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于工艺流程包括制备磺胺二甲基嘧啶-BSA 偶联物、制备抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体、制备胶体金溶液、制备胶体金标记抗磺胺二甲 基嘧啶单克隆抗体和组装磺胺二甲基嘧啶免疫胶体金快速检测试剂板。
全文摘要
本发明涉及一种检测蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶残留的试剂板的制备方法，可用于检测蜂蜜中的磺胺二甲基嘧啶。本发明试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需20～30min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合工商部门、检验检疫机构、养蜂场及蜂产品生产加工企业对原料及产品中的磺胺二甲基嘧啶进行大规模快速检测。
文档编号G01N33/577GK101949922SQ20101025201
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月11日 优先权日2010年8月11日
发明者张少恩, 桑丽雅, 邵伟 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司