专利名称：单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定 单胺氧化酶活性浓度的测定方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
单胺氧化酶(MAO)测定可分为化学分光光度法、荧光法、免疫 抑制法及现在申请专利的酶法。 一般多用化学分光光度法，单胺氧化 酶反应底物以苄胺(Benzylamine)和对苯甲胺-P -偶氮萘酚，也可应 用单胺氧化酶催化胺类释放出的HA氧化发色剂，如10-N-甲基氨基甲 酰基-3， 7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，单胺氧化酶 反应底物还有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 e-苯乙 基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine: 3-对羟基苯乙胺 3-parahdroxyphenylethylamine)、 5-羟色胺(5-hydroxytrypt腿ine) 等，丁基胺、戊基胺、P -苯乙基胺约为3-对羟基苯乙胺活性的30%， 通常应用苯甲胺作为底物比其他底物的单胺氧化酶活性要高。目前单 胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-P -偶氮萘酚为底物，但对苯甲胺-e-偶氮萘酚苄胺法需要用环乙垸提取，限制了该方法的实用性，且不 能应用全自动生化仪分析；苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用 下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生 成醛苯腙，在生化仪上测定也较困难。
荧光法检测单胺氧化酶是以e -苯乙胺作为底物，其在1(Tl00mg
时Km最大，高于苄胺和5-羟色胺的Km值。
免疫学方法是利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，作用
后进行单胺氧化酶同工酶测定。目前应用较多的单克隆抗体是 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MA0-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶 (还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶 活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的单胺氧化 酶诊断试剂盒，釆用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度的测定，而且测定速度快、 准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明单胺氧化酶活性浓度测定方法原理如下
胺类化合物+ 2水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+
氨离子+过氧化氢+ 2 OH— 氨离子+ a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨离子+ a-酮戊二酸+
过氧化氢
胺类化合物可以是苄胺、对苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊 基胺、3-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺等或其衍生物。
这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine Oxidase EC 1.4.3.4、EC 1.4.3.6)将胺类化合物酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1,4.1.3 或EC 1.4.1.4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)作为循环酶谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷 氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及a-酮戊二酸，使氨不断地被 重复循环利用。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3 或EC 1.4丄4)作为显色酶，使还原型辅酶(在340nm处有吸收 峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测 定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处 吸光度下降的速度，可以测算出单胺氧化酶活性浓度。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明单胺氧化酶 试剂盒较为理想
缓冲液 lOOmmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脱氢酶 50000 U/L
谷氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16 mmol/L
本发明的单胺氧化酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脱氮酶、谷氨 酸氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定单胺氧化酶活性浓度的方 法，其还原型辅酵可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为单试剂，包括-
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脱氢酶 50000 U/L
谷氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；
使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间IO分钟，起
始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样
品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方
法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。 .加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生
化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺
氧化酶活性浓度的大小。
实施例二
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为双试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶
a-酮戊二酸
0.25薩ol/L 12 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷氨酸脱氢
谷氨酸氧化l
50 mmol/L
40000 U/L
15000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测样品 与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)， 检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧 化酶活性的浓度大小。 实施例三
本实施例的单胺氧化酶诊断试剂为三试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
a-酮戊二酸
10O蘭ol/L 50 mmol/L
0.25腿ol/L 10 mmol/L
试剂2
100腿ol/L 50 mmol/L 20000 U/L
100腿ol/L 50 mmol/L 60000 U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
谷氨酸脱氢酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
谷氨酸氧化酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定单胺氧化酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度
37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，
测试副波长405nm，被测样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为
4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟
时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧
化酶活性浓度的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化
分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外
源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法原理如下胺类化合物+2水+氧 单胺氧化酶 相应醛类产物+ 氨离子+过氧化氢+2 OH-氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸 +辅酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+ 过氧化氢胺类化合物可以是苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺等或其衍生物。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶活性浓度大小测定结果。单胺氧化酶(Monoamine Oxidase EC 1.4.3.4、EC 1.4.3.6)作为作用酶，功能为将胺类化合物酶解产生氨。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶谷氨酸脱氢酶的酶促作用产生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为显色酶，使还原型辅酶变成为辅酶，在340nm波长下发生吸光度下降，从而可以测算出单胺氧化酶活性浓度。还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
2. —种单胺氧化酶诊断试剂盒，主要成分包括-缓冲液 40——500 mmol/L稳定剂 1——50mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L谷氨酸脱氢酶 2000——500000 U/L 谷氨酸氧化酶 2000——500000 U/L a-酮戊二酸 2——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)组成单剂 .试剂。
4. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶 (glutamate dehydrogenase EC 1,4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、 谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)组成双 剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶组 成。a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶在试剂1或试剂2 中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶 (glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、 谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)组成多 剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、a-酮戊二酸组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱氢酶组成；试剂3，由 缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶组成。a-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、 谷氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1--4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为 硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的单胺氧化酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒可以是干粉状态，在使用前溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、还原型辅酶及稳定剂，这些成分可以配成单剂试剂盒、双剂试剂盒及三剂试剂盒；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶(偶)促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度大小，从而测算出单胺氧化酶活性的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
文档编号G01N33/50GK101097202SQ200610085589
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司