专利名称：检测马冠状病毒抗体的方法及专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物传染病检测方法及试剂盒。
背景技术：
马冠状病毒(ECV)为单股正链RNA病毒。1975年美国地区发生40多例新生幼驹以水样腹泻、发烧和淋巴组织病变为特征的传染性疾病，最后被证明是马冠状病毒(Equine coronavirus，ECV)感染所致。1983年Huang JC等又从具有严重腹泻的病马体内分离到ECV，从此ECV也就走进了人们研究的视线，并取得了一定的研究进展。
建立特异快速的ECV诊断方法是控制消灭ECV的前提。目前，顾炳泉等在澳大利亚实验室建立起一个有效的RT-PCR诊断方法，可以对粪便和病料中ECV病原进行检测，敏感性和特异性均较高。在此基础上，通过对条件的优化，研制了RT-PCR检测马冠状病毒试剂盒。
RT-PCR检测马冠状病毒的方法虽然敏感性和特异性均较高，但手段比较繁琐，费用也较高，且对技术的要求也很高，如果对待检马的血清进行检测，那么相对来说，检测过程将会相对简单，费用和对技术的要求也较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测简单、方便，检测效果好的检测马冠状病毒抗体的方法及专用试剂盒。
本发明的技术解决方案是
一种检测马冠状病毒抗体的方法，其特征是包括下列步骤(1)包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板的制备用22mM碳酸钠溶液包被真核系统表达的总蛋白，包被浓度10μg/ml，100μl/孔加入ELISA(酶联免疫吸附试验)板孔中，4℃16小时，弃去包被液，用磷酸盐缓冲液洗涤，用吸水纸拍干，用5％脱脂奶粉液满孔封闭，并用磷酸盐缓冲液洗涤，干燥后得包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板，即反应板；(2)反应板每空加入待检马血清，37℃反应45min，同时设空白对照B、阴性对照N、阳性对照P；其中待检马血清以1∶100比例用PBST(含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液)稀释，阴性对照N是阴性马血清与PBST以1∶100比例稀释，阳性对照P是昆虫细胞总蛋白免疫的阳性小鼠血清与PBST以1∶200的比例稀释；弃去孔内液体，每孔加入磷酸盐缓冲液洗涤，用吸水纸拍干；(3)每孔加入酶标记的抗马IgG单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液洗涤，吸水纸拍干；(4)每孔加入新鲜配制的0.4～1.2mg/ml的邻苯二胺(ODP)底物应用液显色，37℃避光显色，显色结束后，每孔加入2M/L H2SO450μl/孔终止显色，测定OD490nm值。
邻苯二胺底物应用液是在底物缓冲液中加入0.15％的30％H2O2制成，底物缓冲液是4.86ml的0.1M的柠檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氢二钠溶液的混合液。
酶标记的抗马IgG单克隆抗体制备方法为每孔加入抗马IgG单克隆抗体，37℃反应45min，用磷酸盐缓冲液洗涤、吸水纸拍干，然后每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠IgG，37℃反应45min。
一种检测马冠状病毒抗体的方法专用试剂盒，其特征是包括有(1)包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板；(2)10×浓缩稀释液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80(吐温-80)的磷酸盐缓冲液；(3)10×浓缩洗液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液；(4)单抗抗马IgG单克隆抗体，工作浓度为1∶2000；(5)HRP标记兔抗鼠IgG；(6)底物缓冲液4.86ml的0.1M的柠檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氢二钠溶液的混合液；(7)双氧水30％的双氧水；(8)邻苯二胺；(9)终止液2N H2SO4；(10)标准液昆虫细胞总蛋白免疫的阳性小鼠血清。
本发明运用真核表达系统，重组杆状病毒(rBac-ECV-N)感染昆虫细胞，大量扩增并获得马冠状病毒核衣壳基因表达的蛋白。所表达的蛋白抗原包被ELISA板，加入待检马血清、抗马IgG单克隆抗体、HRP酶标抗体，研制出了简单、方便安全、特异有效、灵敏廉价的方法和试剂盒，便于马冠状病毒的诊断和疫情监测及动物疾病的治疗，控制该病的流行和发生。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式(1)马冠状病毒核衣壳基因片段在原核系统中的表达根据NCBI发表ECV核衣壳基因序列，设计特异性引物，用PCR方法扩增出ECV核衣壳基因片段；将该基因片段插入表达型载体pGEX-6p-1中，并转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒pGEX-ECV-N。提取pGEX-ECV-N质粒，经BamH I、EcoR I双酶切鉴定正确后，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达，并用SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果证明本研究成功表达了GST-ECV-N融合蛋白。融合蛋白切胶免疫小鼠，其原核表达产物具有免疫原性。
(2)马冠状病毒核衣壳基因片段在真核系统中的表达用BamHI和EcoRI将ECV-N从pGEX-ECV-N载体切下，回收目的DNA片段，克隆到杆状病毒转移载体pFastBacl，并转化大肠杆菌DH5α。用BamH I、EcoR I双酶切鉴定，筛选出重组转移载体pFastBac-ECV-N，然后将载体质粒DNA转化含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在转座子作用下，构建重组穿梭质粒Bacmid-ECV-N。提取正确重组的穿梭质粒DNA转染Sf9昆虫细胞，结果获得了重组杆状病毒rBac-ECV-N。PCR进一步鉴定结果表明，ECV-N基因片段已重组到杆状病毒基因组中；用上述原核表达融合蛋白GST-ECV-N免疫小鼠制备的多抗血清与重组杆状病毒感染的细胞进行间接免疫荧光试验，结果证明，ECV-N在重组杆状病毒中得到了很好的表达。
(3)抗马IgG单克隆抗体的研制用饱和硫酸铵法提取健康马血清中的IgG，免疫Balb/c小鼠，取其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，制抗马IgG的单克隆抗体。用ELISA检测融合细胞上清，结果筛选出两株抗马IgG的单克隆抗体，命名为EQ-IgG-3D10，EQ-IgG-6G6。两株单抗生物学特性研究表明单抗亚类EQ-IgG-3D10亚类为IgG2b，EQ-IgG-6G6亚类为IgG3；单抗EQ-IgG-3D10细胞上清和腹水工作效价分别为1∶64和1∶5000，单抗EQ-IgG-6G6细胞上清和腹水工作效价分别为1∶512和1∶40000；单抗EQ-IgG-6G6与马IgG有Western-blot反应性；两株单抗对马立克氏病病毒蛋白、重组新城疫病毒蛋白、猪IgG、兔血清、鼠血清等均无交叉反应，证明这些单抗具有良好的特异性。
(4)血清中马冠状病毒抗体检测方法的建立将重组杆状病毒rBac-ECV-N大量感染Sf9昆虫细胞，以表达出的ECV-N蛋白作为抗原，以抗马IgG特异性单抗为二抗，建立检测马抗冠状病毒抗体的ELISA方法。结果表明，ECV-N蛋白质最佳包被浓度为昆虫细胞总蛋白10μg/mL，单抗EQ-IgG-6G6上清1∶10稀释可以鉴别出阳性抗马冠状病毒血清抗体。并组建了相应检测试剂盒，提出了判定标准即OD490读值≥0.7为阳性马血清，OD490读值为0.4-0.7时，判为可疑，OD490读值＜0.4，判为阴性。
(5)按照血清中马冠状病毒抗体检测方法的的建立进行试剂盒的组装包括有①包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板8×12孔酶标板；②10×浓缩稀释液(A号瓶)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液；③10×浓缩洗液(B号瓶)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液；
④单抗(C号指形管)抗马IgG单克隆抗体，工作浓度为1∶2000；⑤HRP标记兔抗鼠IgG(D号指形管)；⑥底物缓冲液(E号瓶)4.86ml的0.1M的柠檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氢二钠溶液的混合液；⑦双氧水(G号瓶)30％的双氧水；⑧邻苯二胺(OPD片剂)；⑨终止液(H号瓶)2N H2SO4；⑩标准液(N号指形管)昆虫细胞总蛋白免疫的阳性小鼠血清。及封板膜、使用说明书。
试剂盒中各组分的制备①包被有马冠状病毒核衣壳基因真核表达产物的聚苯乙烯酶标板用22mM的碳酸盐溶液将抗原，包被浓度10μg/mL，100μL/孔加入ELISA板孔中，4℃16小时；用洗液(PBST)洗涤3次，用封闭液(5％的脱脂奶粉)37℃湿盒封闭60分钟，洗液洗3次，干燥后即为反应板。
②浓缩稀释液(10×)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液(PBST)。按常规法配制，4℃分装保存。
③浓缩洗液(10×)0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液(PBST)。按常规法配制，4℃分装保存。
④抗体工作浓度为1∶2000，-70℃保存。
⑤酶标抗体购自Sigma公司。工作浓度为1∶30000，-20℃保存。
⑥底物缓冲液磷酸氢二钠14.2g，柠檬酸10.5g，加去离子水定容至500mL，分装4℃保存。
⑦底物溶液在底物缓冲液中加入0.15％的30％的H2O2。
⑧终止液0.2M硫酸溶液。
⑨底物片剂邻苯二胺片剂。底物片剂在4℃避光保存1年以上应稳定、不变色，放入底物缓冲液中应在2-3分钟溶解。
(6)临床血清样品检测用建立检测试剂盒对1064份马血清进行了检测，结果表明国内马血清中检测出7份阳性血清，6份疑似阳性；澳大利亚马血清中检测出23份阳性阳性血清，8份疑似阳性；而瑞典马血清中没有检测到阳性和疑似阳性的血清。
①检测血样的处理采集马血，离心取上清备用。
②测定方法血清中马冠状病毒抗体检测试剂盒的操作方法及结果分析使用前取B瓶液(浓缩洗涤液)按1∶10用蒸馏水稀释至工作浓度为洗涤液；C管液100μL用A液1∶100稀释待用；D管液100μL用A液1∶100稀释待用；N管液用A液作系列梯度稀释待用。先将样品分别加入待检孔中，37℃水浴作用45分钟，弃去孔内液体，每孔加入洗涤液至满孔，弃去洗涤液，于吸水纸上拍干，重复洗涤3遍；每孔中加入单抗，在板外37℃水浴作用45分钟，弃去孔内液体，每孔加入洗涤液至满孔，弃去洗涤液，于吸水纸上拍干，重复洗涤5遍。洗涤后立即在每孔中加入稀释好的D液100μL，置37℃水浴45分钟。弃去孔内液体，每孔加入洗涤液至满孔，放置2min，弃去洗涤液，于吸水纸上拍干，重复洗涤5遍。将F管中片剂(4～12mg)溶于10mL底物缓冲液(E液)，完全溶解后，加入30ul G液混匀后每孔加入100μL，37℃避光显色30min。显色结束，每孔加50μL的H液；以A1孔为调零孔，用酶标仪测定样品的OD490值。
结果判定标准加入H液后各孔颜色由黄色变为橙红色，用酶标仪测定在490nm波长处每孔的光吸收值(OD490值)，判定标准为OD490读值≥0.7为阳性马血清，OD490读值为0.4-0.7时，判为可疑，OD490读值＜0.4，判为阴性。
权利要求
1.一种检测马冠状病毒抗体的方法，其特征是包括下列步骤(1)包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板的制备用22mM碳酸钠溶液包被真核系统表达的总蛋白，包被浓度10μg/ml，100μl/孔加入ELISA板孔中，4℃16小时，弃去包被液，用磷酸盐缓冲液洗涤，用吸水纸拍干，用5％脱脂奶粉液满孔封闭，并用磷酸盐缓冲液洗涤，干燥后得包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板，即反应板；(2)反应板每空加入待检马血清，37℃反应45min，同时设空白对照B、阴性对照N、阳性对照P；其中待检马血清以1∶100比例用PBST稀释，阴性对照N是阴性马血清与PBST以1∶100比例稀释，阳性对照P是昆虫细胞总蛋白免疫的阳性小鼠血清与PBST以1∶200的比例稀释；弃去孔内液体，每孔加入磷酸盐缓冲液洗涤，用吸水纸拍干；(3)每孔加入酶标记的抗马IgG单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液洗涤，吸水纸拍干；(4)每孔加入新鲜配制的0.4mg/ml的邻苯二胺底物应用液显色，37℃避光显色，显色结束后，每孔加入2M/L H2SO450μl/孔终止显色，测定OD490nm值。
2.根据权利要求1所述的检测马冠状病毒抗体的方法，其特征是邻苯二胺底物应用液是在底物缓冲液中加入0.15％的30％H2O2制成，底物缓冲液是4.86ml的0.1M的柠檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氢二钠溶液的混合液。
3.根据权利要求1或2所述的检测马冠状病毒抗体的方法，其特征是酶标记的抗马IgG单克隆抗体制备方法为每孔加入抗马IgG单克隆抗体，37℃反应45min，用磷酸盐缓冲液洗涤、吸水纸拍干，然后每孔加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG，37℃反应45min。
4.一种检测马冠状病毒抗体的方法专用试剂盒，其特征是包括有(1)包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板；(2)10×浓缩稀释液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液；(3)10×浓缩洗液0.1M pH7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液；(4)单抗抗马IgG单克隆抗体，工作浓度为1∶2000；(5)HRP标记兔抗鼠IgG；(6)底物缓冲液4.86ml的0.1M的柠檬酸和5.14ml的0.2M的磷酸氢二钠溶液的混合液；(7)双氧水30％的双氧水；(8)邻苯二胺；(9)终止液2N H2SO4；(10)标准液昆虫细胞总蛋白免疫的阳性小鼠血清。
全文摘要
本发明公开了一种检测马冠状病毒抗体的方法及专用试剂盒，包括包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板的制备、反应板每空加入待检马血清反应、加入酶标记的抗马IgG单克隆抗体、显色、测定OD490nm值等步骤。本发明运用真核表达系统，重组杆状病毒感染昆虫细胞，大量扩增并获得马冠状病毒核衣壳基因表达的蛋白。所表达的蛋白抗原包被ELISA板，加入待检马血清、抗马IgG单克隆抗体、HRP酶标抗体，研制出了简单、方便安全、特异有效、灵敏廉价的方法和试剂盒，便于马冠状病毒的诊断和疫情监测及动物疾病的治疗，控制该病的流行和发生。
文档编号G01N33/544GK101017173SQ20071002039
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者顾炳泉, 秦爱建, 冉俊祥, 李建, 陶宏锦, 王金龙, 张敬友, 孙谦 申请人:中华人民共和国南通出入境检验检疫局