专利名称：：溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种农药残留检测方法及其应用，更具体地说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测食品中溴氰菊酯的残留。
背景技术：
：溴氰菊酯(Deltamethrin)是我国用量最大的拟除虫菊酯类农药，具有用药量小，药效快，毒性相对低等优点，被广泛应用于农业、林业、公共卫生等，但它的高频次使用导致了该类农药在作物体及其农副产品中的残留水平较高，造成了环境污染，破坏了生态平衡，直接或间接危及到了人类的健康，若人们经常性摄入含有该类农药残留的水果、蔬菜、茶叶等农副产品，极易造成慢性或亚慢性中毒。因此，各国对溴氰菊酯在农副产品中的残留监控也愈来愈严，一些国家制定了严格的限量标准，致使我国出口的农产品屡屡发生被拒收、扣留、退货等事件，造成了巨大的经济损失。因此，建立一种快速准确的溴氰菊酯检测方法是迫在眉睫之事。在此背景下，具有高特异性和灵敏度的免疫分析技术近年蓬勃发展起来，该技术可避免复杂分析样本中杂质的干扰，并简化前处理的歩骤。溴氰菊酯是小分子化合物(分子量<1000)，本身不具有诱导产溴氰菊酯(Deltamethrin)生抗体的能力，因此，建立溴氰菊酯ELISA检测方法的第一步是合成具有免疫原性和抗原性的人工完全抗原，该人工抗原本实验室已设计完成，并获得了国家专利，名称为"一种溴氟菊酯人工抗原的合成方法及测定方法"，申请号为200610144966.8。在此基础上，本发明利用已合成的人工抗原免疫动物，得到针对溴氰菊酯的多克隆抗体，对该抗体进行特性鉴定的同时，建立优化了溴氰菊酯的ELISA检测方法。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。酶联免疫技术是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术，根据检测目的、试剂来源和实验条件，可设计出多种类型的方法，因此，选择适合的ELISA检测方法也是建立农药快速免疫分析技术的关键所在。目前，国内关于溴氰菊酯免疫分析技术的研究仍处于初歩阶段，尚无快速检测方法建立。本发明建立的溴氰菊酯ELISA检测技术具有灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分析费用低、仪器化程度要求不高等特点，便于推广，若把这种技术转化为试剂盒，可商品化大规模生产，具有很好的经济效益和社会效益。
发明内容1、发明目的本发明的目的在于提供一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法及其应用，它是一种快速检测食品中溴氰菊酯农药残留的酶免疫学方法，使样品无须经过繁瑣的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏感性及特异性。2、技术方案本发明的技术方案如下本发明一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，所述方法为利用溴氰菊酯半抗原(DM)和牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(DM-BSA)免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以溴氰菊酯为标准品，以DM和鸡卵清白蛋白(OVA)的偶联物(DM-OVA)作为包被抗原，建立食品中溴氰菊酯农药的间接竟争酶联免疫法。具体地，多克隆抗体的制备步骤为(1)实验动物4月龄雄性新西兰大白兔，体重约2kg;(2)免疫方法第l周耳缘静脉釆血约lmL,备用。首次基础免疫用弗氏完全佐剂0.4mL与0.4mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮内多点注射；2周后进行加强免疫，弗氏不完全佐剂0.5mL与0.5mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行二次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.6mL与0.6mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行三次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.7mL与0.7mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。每次免疫间隔2周；(3)釆血四免后，耳脉静脉釆血间接ELISA法测定抗血清效价，达到2404后，心脏釆全血，分离抗血清。酶联免疫检测具体步骤为(1)加抗原用包被缓冲液以体积比1:1600稀释人工抗原(DM-OVA)后,加入96孔酶标板中，每孔加100pL,37。C孵育3h;按照常规ELISA法封闭洗涤;(2)加抗体用样品稀释液以体积比1:1600稀释抗体后，与标准品(或样品)等体积混合，每孔加100pL,37。C孵育30min后洗涤液(PBST)洗涤4次；(3)加酶标二抗用样品稀释液以体积比1:IOOO稀释辣根酶标记的山羊抗兔IgG后，每孔加100pL，37。C孵育30min后PBST洗涤4次；(4)加显色液每孔加显色液lOOjiL,37。C避光显色15min;(5)加终止液每孔加终止液100pL;(6)测定酶标仪490nm测吸光度OD值。更详细的步骤为(1)ELISA测定所需试剂的配制磷酸盐缓冲溶液PBS(pH7.4，O.Olmol.L"):40gNaCl、1gKCl、lgKH2P04和14.5Na2HP04'12H20用蒸馏水定容至5L;包被缓冲液(pH9.6,0.05mol'L"):0.5gNaC03和1.464gNaHC03用蒸馏水定容至500mL;洗涤液PBST:1000mLPBS中加lmLTween-20;样品稀释液500mLPBS中加0.5mLTween-20和0.5g明胶；底物缓冲液(pH5.0):2.55g柠檬酸和9.215gNa2HP04'12H20用蒸馏水定容至500mL后，再加0.5mLTween-20;显色液称取20mg-40mg邻苯二胺溶于20mL底物缓冲溶液中，再加入20-30pL的30%双氧水(现用现配)；终止液2mol丄"H2S04。(2)加抗原用包被缓冲液以体积比1:1600稀释人工抗原(DM-OVA)后，加入96孔酶标板中，每孔加lOO(iL,37。C孵育3h。按照常规ELISA法封闭洗涤；(3)加抗体用样品稀释液以体积比1:1600稀释抗体后，与标准品(或样品)等体积混合，每孔加100pL，37。C孵育30min后洗涤液(PBST)洗涤4次；(4)加酶标二抗用样品稀释液以体积比1:IOOO稀释辣根酶标记的山羊抗兔IgG后，每孔加lOOjiL,37。C孵育30min后PBST洗涤4次；(5)加显色液每孔加显色液100pL，37。C避光显色15min;(6)加终止液每孔加终止液lOO(iL;(7)测定酶标仪490nm测吸光度OD值。本发明同时公开了一种所述的溴氰菊酯酶联免疫检测方法的应用，所述检测方法应用于实际食品样品检测，具体步骤为将溴氰菊酯溶于甲醇，再分别加至一定量的食品中，使溴氰菊酯在食品中的浓度为0.1mg女g—1、0.5mgig"和lmg-kg",再分别加入体积比为4:1的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂，超声萃取，过滤，滤液浓缩至干,再用10呢甲醇的样品稀释液溶解后供ELISA测定。3、有益效果本发明建立了食品中溴氰菊酯农药的间接ELISA法，为溴氰菊酯在食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于釆用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.110-0.237吗'mL"，线性范围为0.015-100吗'mL—1。IC50为lYSGWJO^g'mL-1,回收率为86.2-105.8%。与其它菊酯类农药几乎无交叉反应。样品前处理过程简单，操作方便快捷，条件亦易于实现，对促进农业生产、降低农业成本、减轻污染、改善环境、提高企业的经济效益都具有重要意义。说明书附图图1为溴氰菊酯标准曲线。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明1、仪器96孔酶标板(美国，costar)。科通303-AO型台式培养箱。Model680型酶标仪(美国，Bio-Rad)。KQ-600型超声波清洗器(昆山巿超声仪器有限公司)。RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。2、试剂溴氰菊酯人工抗原(DM-BSA和DM-OVA，按照申请号为200610144966.8、名称为"一种溴氰菊酯人工抗原的合成方法及测定方法"的专利方法实验室合成)。辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，进口分装)。弗氏完全佐剂(美国，sigma)。弗氏不完全完全佐剂(美国，sigma)。3、步骤(1)多克隆抗体的制备1)实验动物4月龄雄性新西兰大白兔，体重约2kg。2)免疫方法第l周耳缘静脉釆血约lmL，备用。首次基础免疫用弗氏完全佐剂0.4mL与0.4mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮内多点注射。2周后进行加强免疫，弗氏不完全佐剂0.5mL与0.5mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行二次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.6mL与0.6mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行三次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.7mL与0.7mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。每次免疫间隔2周。3)釆血四免后，耳脉静脉釆血间接ELISA法测定抗血清效价，达到2\104后，心脏釆全血，分离抗血清。(2)ELISA测定所需试剂的配制磷酸盐缓冲溶液PBS(pH7,4,0.01mol-L"):40gNaCl、lgKC1、lgKH2P04和14.5Na2HP04'12H20用蒸馏水定容至5L;包被缓冲液(pH9.6，0.05mol.L"):0.5gNaC03和1.464gNaHC03用蒸馏水定容至500mL;洗涤液1000mLPBS中加lmLTween-20;样品稀释液500mLPBS中加0.5mLTween-20和0.5g明胶；底物缓冲液(pH5,0):2.55g柠檬酸和9.215gNa2HP04'12H20用蒸馏水定容至500mL后，再加0.5mLTween-20;显色液称取20mg-40mg邻苯二胺溶于20mL底物缓冲溶液中，再加入20-30pL的30%双氧水(现用现配)；终止液2mol丄"H2S04。(3)ELISA反应过程1)加抗原用包被缓冲液以体积比1:1600稀释人工抗原(DM-OVA)后，加入96孔酶标板中，每孔加lOOjjL,37'C孵育3h。按照常规ELISA法封闭洗涤；2)加抗体用样品稀释液以体积比1:1600稀释抗体后，与标准品(或样品)等体积混合，每孔加lOOjiL,37°〇孵育30min后PBST洗涤4次；3)加酶标二抗用样品稀释液以体积比1:1000稀释辣根酶标记的山羊抗兔IgG后，每孔加lOO^L,37。C孵育30min后PBST洗涤4次；4)加显色液每孔加显色液100pL，37。C避光显色15min;5)加终止液每孔加终止液100^L;6)测定酶标仪490nm测吸光度OD值。(4)回收率测定及食品样品提取方法确定溴氰菊酯溶于甲醇，再分别加至一定量的食品中，使溴氰菊酯在食品中的浓度为O.lmg'kg—、0.5mg'kg"和1mg'kg",再分别加入体积比为4:1的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂，超声萃取，过滤，滤液浓缩至干，再用10呢甲醇的样品稀释液溶解后供ELISA测定。将所得的OD值经公式(1)计算得到样品的抑制率，然后通过标准曲线回归方程可知样品中溴氰菊酯农药的残留量。I%=(OD空白对照-OD待测样品)/OD空白对照x100%(1)实验结果如下1、标准曲线本试验所获得的溴氰菊酯检测线性范围为0.015-100吗'ml/1，ICso为^VSGJJO^g'mL-1,检出限为0.011-0.024mg.kg國1。如图1所2、灵敏度评价ELISA反应灵敏度的方法，常用的有ICs。和检出限。检出限(Z)-X-2SD，其中，X是OD值的平均值，SD是标准差。本发明进行20次标准曲线试验，得ICs。为^VSGJJO^g'mL-1,检出限为0.011-0.024mg'kg—、3、交叉反应率利用溴氰菊酯标准品和类似结构的相关化合物进行交叉反应研究，结果见表l。交叉反应率(％)=IC5(:,(溴氰菊酯)/1C5()(竟争物)xlOO%。表1交叉反应率测定结果农药IC5。交叉反应率_(吗'mL/i)(%)溴氰菊酯4.715Deltamethrin氯氰菊酯33.015Cypermethrin氯菊酯>100Permethrin高效氯氟氰菊酯>100Lambda-cyhalothrin甲氰菊酯>100Fenpropathrin生物丙烯菊酯>100<5Bio-allethrin謂143%<5<5<5胺菊酯>100<5Tetramethrin氰戊菊酯>100<5Fenvalerate炔戊菊酯>100<5Empenthrin4、稳定性与重复性实验选择3块酶标板，每块抽出5个微孔，测定5吗-mL"标准溶液的OD值，计算变异系数，结果见表2，变异系数在允许范围之内，结果较为可靠。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5、回收率测定(以苹果为例)加标苹果样品回收后进行ELISA检测，结果见表3。回收率为86.2-105.8%,变异系数为6.0-9.8%,基本符合溴氰菊酯残留检测要求。表3溴氰菊酯在苹果中的添加回收率(n=5)添加浓度(mg'kg-i)回收率(％)变异系数(％)0.1105.8±6.36.00,591.8±3.39,81,086.2±7.48,权利要求1、一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，其特征在于所述方法为利用溴氰菊酯半抗原(DM)和牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(DM-BSA)免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以溴氰菊酯为标准品，以DM和鸡卵清白蛋白(OVA)的偶联物(DM-OVA)作为包被抗原，建立食品中溴氰菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。2、根据权利要求1所述的溴氰菊酯多克隆抗体制备方法，其特征在于多克隆抗体的制备步骤为(1)实验动物4月龄雄性新西兰大白兔，体重约2kg;(2)免疫方法第l周耳缘静脉釆血约lmL,备用。首次基础免疫用弗氏完全佐剂0.4mL与0.4mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮内多点注射;2周后进行加强免疫，弗氏不完全佐剂0.5mL与0.5mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行二次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.6mL与0.6mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行三次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.7mL与0.7mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。每次免疫间隔2周；(3)采血四免后，耳脉静脉釆血间接ELISA法测定抗血清效价，达到2xl0:后,心脏采全血,分离抗血清。3、根据权利要求1所述的溴氰菊酯酶联免疫检测方法，其特征在于酶联免疫检测具体步骤为(1)加抗原:用包被缓冲液以体积比1:1600稀释人工抗原(DM-OVA)后,加入96孔酶标板中，每孔加lOOjiL,37'C孵育3h;按照常规ELISA法封闭洗涤；(2)加抗体用样品稀释液以体积比1:1600稀释抗体后，与标准品(或样品)等体积混合，每孔加100^L,37。C孵育30min后洗涤液(PBST)洗涤4次；(3)加酶标二抗用样品稀释液以体积比1:1000稀释辣根酶标记的山羊抗兔IgG后，每孔加lOOpL,37。C孵育30min后PBST洗涤4次；(4)加显色液每孔加显色液lOOjxL,37。C避光显色15min;(5)加终止液每孔加终止液100nL;(6)测定:酶标仪490nm测吸光度OD值。4、一种如权利要求1-3之任一所述的溴氰菊酯酶联免疫检测方法的应用，其特征在于所述检测方法应用于实际食品样品检测，具体步骤为将溴氰菊酯溶于甲醇，再分别加至一定量的食品中，使溴氰菊酯在食品中的浓度为O.lmg-kg.1、0.5mg-kg"和1mg-kg",再分别加入体积比为4:1的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂，超声萃取，过滤，滤液浓缩至干，再用10%甲醇的样品稀释液溶解后供ELISA测定。全文摘要本发明公开了一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法及其应用，所述检测方法为利用溴氰菊酯半抗原(DM)和牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(DM-BSA)免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以溴氰菊酯为标准品，以DM和鸡卵清白蛋白(OVA)的偶联物(DM-OVA)作为包被抗原，建立食品中溴氰菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。本发明建立了食品中溴氰菊酯农药的间接ELISA法，为溴氰菊酯在食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.110-0.237μg·mL<sup>-1</sup>，线性范围为0.015-100μg·mL<sup>-1</sup>。样品前处理过程简单。文档编号G01N33/543GK101339189SQ20081014744公开日2009年1月7日申请日期2008年8月18日优先权日2008年8月18日发明者婧张,王春娜,贾临芳,赵建庄,魏朝俊申请人:北京农学院