专利名称：：一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于食品安全检测(免疫化学分析技术)领域，涉及一种酶联免疫检测方法及试剂盒，具体涉及一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒。
背景技术：
：牛奶和牛奶制品是大自然赐予人类最理想的、最接近于人奶的天然食品。牛奶的化学成分很复杂，至少有100多种，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖和无机盐等组成。人体蛋白质的氨基酸有20种，其中有8种是人体本身不能合成的，这些氨基酸称为必需氨基酸。牛奶中的蛋白质包含了所有的必需氨基酸。所以牛奶制品中的蛋白质含量是评价牛奶质量好坏的一项重要指标。根据我国灭菌乳GB54082-1999对乳及乳制品质量控制指标，要求100g奶中蛋白质的含量22.9g。由于目前国标GB/T5009.5-1985中规定蛋白质的标准检测方法为凯氏定氮法，其方法是通过检测氮的含量推算得到蛋白质含量，对于氮源不具备识别能力。有一些人通过添加三聚氰胺、尿素等含氮的化学物质或廉价蛋白质来提高牛奶中的"蛋白"含量，以次充好。就加入三聚氰胺C3H6N6而言，其中N的含量是66.66%，而从氮元素计算出乳制品中蛋白质的含量为6.38x66.66%=425%。也就是说1g三聚氰胺中含有4.25g蛋白质，也正是这样的暴利驱使得掺假问题屡禁不绝。面对凯氏定氮法存在的局限性，市场上还有通过测定酪蛋白的含量来判断牛奶中是否掺假的测定方法，但是由于牛奶中的蛋白主要为酪蛋白、乳清蛋白等，单独选用酪蛋白作为蛋白质的评价指标也存在一定的局限性。因此，急需发展一种新型完善的直接检测牛奶及牛奶制品中蛋白质含量的方法，作为评定牛奶的质量和判定牛奶中是否掺假的指标。
发明内容本发明要解决的技术问题在于提供了一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒，增强了特异性、灵敏度和准确性，能满足企业对原料乳和乳制品的质量检测和监督。本发明的技术方案一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括以下歩骤(1)包被Na2COrNaHC03缓冲液(pH9.6)稀释混合蛋白(4~5吗/mL酪蛋白和2~2.5吗/mL(3-乳球蛋白混合液，混合比例2:1)配制混合蛋白包被液，包被96孔酶标板，每孔100nL，4'C放置过夜；(2)封闭弃去包被液，每孔加入150^L封闭液(5Q/。(w/w)以上豆粉，超声3min以上，2000rpm离心5min以上，取上清)，放置恒温恒湿细胞培养箱37°C，孵育2h以上；(3)抗原抗体反应弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤。将混合蛋白梯度标准品或待测样品加入酶标板微孔，每孔50^L。再加入混合蛋白抗体(酪蛋白抗体和p-乳球蛋白抗体以等比例混合制备的混合蛋白抗体，混合比例l:1)，每空50]aL，37X:恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(4)抗原抗体复合物与酶标二抗反应弃去反应液，酶标板用PBST洗涤，加入酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔100pL，37°C恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(5)显色弃去反应液，用PBST洗涤，显色液A(IOmg邻苯二胺溶于25mL0.05M的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH5.0)与显色液B(40%双氧水)按600700:1比例混合，每孔加入100pL混合显色液，恒温恒湿培养箱37'C，孵育25min;(6)终止反应酶标板每微孔加入50pL终止液(12mol/L盐酸)，终止反应；(7)测定用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值。(8)根据检测结果绘制标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑制率(各标准品孔和样品孔吸光度值除以0ng/mL标准品孔吸光度值)。(9)对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白-乳球蛋白的总蛋白含量，根据酪蛋白-乳球蛋白占总蛋白含量，计算全蛋白含量。其中，所述步骤(3)所述的混合蛋白标准品为酪蛋白和(3-乳球蛋白标准品按8:l浓度比例混合，逐级稀释成140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、9000ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL，稀释液为PBST。所述步骤(3)中的待测样品，需进行前处理，处理方法为液态奶制品经过15,000rpm离心5min以上，除去上层油脂层后，混合，稀释20,000~25，000倍。奶粉样品稀释至4~6|ag/mL。稀释液为PBST。由于不同乳制品批次间会存在差异，空白样品和显色情况会存在差异，而且实验人员操作也会有细微差异，因此每块酶标板上需要进行标准品梯度的测试，从而制作标准曲线，将检测结果带入线性回归线方程，得到样品检测结果。上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。5本发明还提供了一种基于上述方法的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板为96孔包被的酶标板；在酶标板的每孔内，包被有酪蛋白和P-乳球蛋白混合得到的混合蛋白抗原；所述的试剂包括混合蛋白标准品、混合蛋白抗体干粉，酶标记羊抗兔抗体干粉、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液。其中所述混合蛋白标准品为酪蛋白和p-乳球蛋白标准品按8:1浓度比例混合，逐级稀释成140,6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、9000ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL。所述混合蛋白抗体干粉为酪蛋白抗体和(3-乳球蛋白抗体以等比例混合制备的混合蛋白抗体。所述酶标记的羊抗兔抗体冻千品为HRP-羊抗兔抗体干粉。所述洗涤液为含有吐温的磷酸盐缓冲液(PBST)。所述显色液A为含有邻苯二胺的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。所述显色液B为20~40%双氧水溶液。所述终止液为盐酸溶液(l~2mol/L)。有益效果本发明所提供的酶联免疫检测方法及试剂盒采用间接竞争ELISA法同时测定牛奶中酪蛋白和P-乳球蛋白含量，通过对接近全蛋白含量85%以上蛋白的检测，计算出总蛋白含量，全蛋白指标可以用于评价原料乳和乳制品的质量并进行质量监督。具体优点有1.本发明方法通过抗原抗体的免疫特异性反应进行蛋白质含量的检测，具有高特异性特点，与非蛋白氮(三聚氰胺，尿素等)、植物蛋白等均无交叉反应。2.本发明试剂盒结构简单，检测成本低，灵敏度高，准确性好，检出限可达108ng/mL。3.检测时间短，特别适合应对公共突发事件的高通量的现场快速检测。全蛋白指标可以满足质检部门和企业对原料与和乳制品的质量进行检测和监督。具体实施例方式以下提供的实施例用于理解本发明，对本发明的内容和保护范围不做任何限制。实施例中的方法如无特别说明均为常规方法。实施例1.本实施例给出了一种间接ELISA竞争法检测牛奶中混合蛋白的含量的检测方法，该方法需要包被酶标板，并配制试剂，下面对酶标板的包被和试剂的配制步骤进行详细的说明。1.包被抗原用50mmol/LNa2C03-NaHC03缓冲液(pH9.6)稀释混合蛋白包被液(5吗/mL酪蛋白和2.5吗/mLP-乳球蛋白混合液)，包被96孔酶标板，每孔100^L，4T放置过夜。弃去包被液，每孔加入150封闭液(5%(w/w)豆粉，超声5min,2000rpm离心5min，取上清)，放置恒温恒湿细胞培养箱37'C，孵育2h;弃去封闭液，真空抽干，板条密封后-20'C冷冻保存。2.试剂的配制.-(1)混合蛋白标准品(酪蛋白/(3-乳球蛋白)酪蛋白和P-乳球蛋白标准品按8:l浓度比例混合，逐级稀释成140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、9000ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL，稀释液为PBST。(2)混合蛋白抗体酪蛋白抗体和(3-乳球蛋白抗体以等比例混合制备混合蛋白抗体。其中，酪蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，P-乳球蛋白抗体购自ImmunologyConsultantsLaboratory，Inc.。(3)HRP标记的羊抗兔抗体冻干品(HRP-羊抗兔抗体)购自北京成文免疫化学研究室。(4)洗涤液PBST。(5)显色液A:10mg邻苯二胺溶于25mL0.05M的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)。(6)显色液B:100pL双氧水。(7)终止液1mol/L盐酸。实施例2.本实施例给出了一种间接ELISA竞争法检测牛奶中混合蛋白的含量的检测方法具体实施方式，下面对该方法的具体检测步骤进行详细说明。1.样品测定(1)样品前处理液态奶制品(以中国计量科学研究院提供液态奶为例)经过15000rpm离心5min，除去上层油脂层后，混合，稀释24,000倍。奶粉样品(以中国计量科学研究院提供奶粉BW3832-2为例)稀释至5ng/mL。稀释液为PBST。(2)实验步骤酶标板制备见实施例1。7取包被有混合蛋白的酶标板，每孔加入200pL洗涤液洗涤3次，每次3分钟。在相应的酶标板微孔中加入混合蛋白标准品或样品溶液，每孔50^L;再加入混合蛋白抗体，每孔50pL，恒温恒湿培养箱37"C,孵育0.5h;弃去反应液，酶标板用PBST洗涤3次，加入酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔100^L，37。C恒温恒湿培养箱，孵育0.5h;弃去反应液，用PBST洗涤板3次，显色液A与显色液B按625:1比例混合，每孔加入lOO(iL混合显色液，恒温恒湿培养箱37"C，孵育25min;酶标板每微孔加入50终止液(lmol/L盐酸)，终止反应；用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值。根据标准品梯度的检测结果，绘制标准曲线，用MicrosoftExcel制作标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑制率(各标准品孔和样品孔吸光度值除以0ng/mL标准品孔吸光度值)。对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白-乳球蛋白的总蛋白含量。2.实验结果标准品混合蛋白线性范围为70.3ng/mL~36000ng/mL，用酶标仪于492nm处测得每孔的吸光光度值，绘制标准曲线。间接ELISA竞争法检测牛奶蛋白标准曲线所图1所示。依据标准曲线，可得稀释奶制品样品的浓度，乘以稀释倍数可得实际样品中混合蛋白的含量，按照样品中酪蛋白和P-乳球蛋白含量占总蛋白含量的87%，计算可得到奶制品中全蛋白的含量，检测结果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.方法验证(1)回收率检测分别在奶基质中加入混合蛋白标准品562.5ng/mL(500ng/mL酪蛋白和62.5ng/mLP-乳球蛋白混合)，1125ng/mL(1000ng/mL酪蛋白和125ng/mLp-乳球蛋白混合)，2250ng/mL(1000ng/mL酪蛋白和125ng/mL(3-乳球蛋白混合)，实验方法同实施例2中1(2)，对照标准曲线，计算加标回收率。结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>BW3832-2112522501107.002117.2598.4±7.894.1±9.8由表中结果可见，对于三种不同奶制品进行的家表回收率显示，该方法的回收率介于90.9%~106.6%之间，偏差介于2.4-9.8%之间。(2)精密度实验酪蛋白和P-乳球蛋白标准品按奶制品中的实际比例8:l浓度比例混合，配制成140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、9000ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL的标准混合蛋白，对其进行检测，实验方法同实施例2中1(2)，每一标准浓度做三次重复，计算标准偏差(SD)，以其孔间变异系数(CV)表示板内误差。在不同时间用不同酶标板重复实施例2中1(2)中的操作3次，测定OD值，计算出每个浓度的标准偏差和变异系数，以其板间变异系数表示板间误差。实验结果如下酪蛋白质量浓度板内误差板间误差(ng/mL)均值Bi/BO(%)SD平均抑制率的均值SDCV(%)70.388.881.4989.051.69l,卯140.682.490.8482.810.410.50281.275.193.5574.32U41.54562.567.836.3168.461.562.281125.063.493.5161.391.832.972250.056.003.4052.633.286.234500.045.363.1442.542.786,539000.033.794.5534.250.531.5618000.026.520.4625.131.305.1736000.019.261.2415.892,920.61平均值55.882.8554.651.742.93从表中结果得到，本试验方法的板内变异系数CV=SD均值/平均孔间结合率xlOO%=2.85/55.88xlOO%=3.03%。板间误差是以3块板的结合率值进行平均，求出各浓度的板间变异系数，再平均求得其总板的板间变异系数(CV),测定结果板间变异系数介于0.50%~6.53%，平均值为2.93%。(3)干扰实验在现有的牛乳制品蛋白质检测方法中，对于掺假使用的非蛋白氮或其他种源蛋白的辨别是一个突出问题，这些物质对于实验检测的干扰水平，是评价快速检测方法的一个重要指标。酶联免疫方法是利用抗原和抗体的特异性结合实现的检测手段，对于免疫方法的选择，事实上取决于待测物和其他物质的干扰反应。含有与待测物结构相近或含有结构部分的物质，就可能出现干扰反应，出现假阳性，因此，对于在实际生产生活中，掺假常用的物质进行干扰实验验，能从根本上评价此方法的可行性。9本实验中，选择了常见的三种非蛋白氮物质三聚氰胺、三聚氰酸、尿素，以及植物蛋白豆粉，进行干扰试验。选取三个浓度PBST溶解，比较浓度变化，对于检测结果的影响。同时，在奶中添加两个浓度的干扰物，进行检测，与不添加干扰物时检测奶样的结果进行比较，考察检澳'!)结果。实验方法实施例2中1(2)，设置空白对照。结果如下种类添加量吸光度混合蛋白浓度(ng/ml)RSD(%)空白2.387样品奶1.2311212.04三聚氰胺10mg/ml2,38550mg/ml2.397250mg/ml2.398奶+10mg/ml1.2161275.515.24奶+50mg/ml1.2131291.056.52三聚氰酸1Omg/ml2.31650mg/ml2.329250mg/ml2,324奶+10mg/m1.2261234.261.84奶+50mg/ml1.2221251.463.26尿素50mg/ml2.362500mg/ml2.3775000mg/ml2.361奶+50mg/ml1.2171271.104.88奶+500mg/ml1.2151279.935.60豆粉5ug/ml2.37650ug/ml2.388500ug.ml2.368奶+5ug/ml1.2231249,303.08奶+50ug/ml1.2051327.289.51表中结果可以看到，增加干扰物的浓度，检测得到的OD值基本不发生变化，说明本实验对于干扰物的无特异性反应。在奶基质中添加干扰物的检测结果，可以看到，添加成份，对于奶制品的检测无影响，检测结果与未添加的阴性对照结果偏差很小，精确度高。实施例3.本实施例给出了一个根据本发明的原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫(ELISA)检测方法的检测试剂盒，该试剂盒包括(1)96孔板(8条xl2孔)，包被有混合蛋白标准品(2)混合蛋白标准液共10瓶，浓度分别为140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、9000ng/mL、18000ngZmL、36000ng/mL、72000ng/m]L。(3)混合蛋白抗体冻干品酪蛋白抗体和(3-乳球蛋白抗体以等比例混合制备混合蛋白抗体。其中，酪蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，(3-乳球蛋白抗体购自ImmunologyConsultantsLaboratory，Inc.。(4)HRP-羊抗兔抗体冻干品购自北京成文免疫化学研究室。(5)洗涤液PBST，1瓶。(6)显色液A:10mg邻苯二胺溶于25mL0.05M的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，1瓶。(7)显色液B:40%双氧水，l瓶。(8)终止液1mol/L盐酸，1瓶。可按照实施例2中1(2)实验方法，检测牛原料乳和乳制品中全蛋白含量。本发明包括但不限制于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下，进行的任何局部改进，等同替换，都将视为在本发明的保护范围之内。权利要求1.一种对原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括以下步骤(1)包被Na2CO3-NaHCO3缓冲液，稀释混合蛋白配制混合蛋白包被液，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃放置8小时以上；(2)封闭弃去包被液，每孔加入150μL封闭液，放置恒温恒湿细胞培养箱37℃，孵育2h以上；(3)抗原抗体反应弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤；将混合蛋白梯度标准品或待测样品加入酶标板微孔，每孔50μL；再加入混合蛋白抗体，每空50μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(4)抗原抗体复合物与酶标二抗反应弃去反应液，酶标板用PBST洗涤，加入酶标二抗，每孔100μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(5)显色弃去反应液，用PBST洗涤，显色液A与显色液B按600～700∶1比例混合，每孔加入100μL混合显色液，恒温恒湿培养箱37℃，孵育25min；显色液A包括但不限于10mg邻苯二胺溶于25mL0.05M的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH值为5.0；显色液B包括但不限于40％双氧水；(6)终止反应酶标板每微孔加入50μL的1～2mol/L盐酸，终止反应；(7)测定用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值；(8)根据检测结果绘制标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑制率；(9)对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白-乳球蛋白的总蛋白含量，根据酪蛋白-乳球蛋白占总蛋白含量，得到全蛋白含量。2.—种对原料乳和乳制品中总蛋白含量酶联免疫检测的试剂盒，其特征在于包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板为96孔包被的酶标板；在酶标板的每孔内，包被有酪蛋白和P-乳球蛋白混合得到的混合蛋白抗原；所述的试剂包括混合蛋白标准品、混合蛋白抗体千粉，酶标记羊抗兔抗体干粉、洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。3.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于所述步骤(1)中，稀释混合蛋白包括45ng/mL酪蛋白和22.5ng/mLp-乳球蛋白混合液，混合比例2:1。4.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于所述步骤(2)中，封闭液为5%(w/w)以上的豆粉，进行超声3min以上，2000rpm离心5min以上，取上清得到。5.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于所述步骤(3)中，混合蛋白抗体为酪蛋白抗体和(3-乳球蛋白抗体以等比例混合制备的混合蛋白抗体，混合比例为1:1。6.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于所述步骤(4)中，酶标二抗包括但不限于辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。7.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于所述步骤(3)所述的混合蛋白标准品为酪蛋白和(3-乳球蛋白标准品按8:l浓度比例混合，逐级稀释成140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、U25ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、卯00ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL，稀释液为PBST。8.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法,其特征在于所述步骤(3)中的待测样品，需进行前处理，处理方法为液态奶制品经过15,000rpm离心5min以上，除去上层油脂层后，混合，稀释20,00025,000倍；奶粉样品稀释至46昭/mL;稀释液为PBST。9.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于所述步骤(3)中，洗涤液为含有吐温20的磷酸盐缓冲液PBST。全文摘要本发明公开了一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒，属于食品安全领域。具体为，酶标板包被两种蛋白抗原，加入两种蛋白混合标准品或样品，再加入两种蛋白混合抗体后，游离的蛋白与酶标板上包被的蛋白竞争抗体，洗涤除去未与酶标板上蛋白连接的抗体，并加入HRP-羊抗兔抗体，反应后，洗涤除去未连接的二抗；加显色液、终止液后，酶标仪测定其吸光度值，对照标准曲线，可得样品中酪蛋白和β-乳球蛋白总含量，根据比例，计算得到牛乳制品中总蛋白含量。本试剂盒是检测方法的一种实现形式，该检测方法具有高特异性、高灵敏度、定量准确、简便等优点，检测线可达108ng/ml，适用于大批样品现场快速检测。文档编号G01N33/543GK101561433SQ20091008482公开日2009年10月21日申请日期2009年5月25日优先权日2009年5月25日发明者吕雪飞,张渝英,向方,李红梅,王洪彬,胡雪娜,邓玉林申请人:北京理工大学