专利名称：大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法
技术领域：
本发明属于农业领域，尤其是涉及一种大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法。
背景技术：
酚酸是指具有某种羧酸功能的酚类，它是植物中仅次于黄酮类化合物的第二大次生代谢物，也是谷物中主要的结合态酚。酚酸是一种良好的抗氧化剂，广泛应用于医药和保健领域，具有预防心血管疾病、抗癌、抗菌、消炎、抗突变和抗艾滋病病毒等多种生物活性。大麦是一种在世界范围内广泛种植的作物，价格低廉，目前主要用作饲料工业和酿造啤酒的原料。大麦籽粒中酚酸类化合物含量较高且种类丰富，其组成成分主要有没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、藜芦酸、水杨酸、间没食子酰没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、邻香豆酸、阿魏酸等，因此，将大麦作为一种提取天然酚酸的重要原材料具有独特的优势，这一产业的发展前景十分广阔。另外，原料大麦中的酚酸是啤酒多酚的重要来源，对啤酒的质量有着很大的影响，对原料大麦籽粒中的酚酸类化合物进行测定十分必要。因此，建立一种简单、快速测定大麦籽粒中酚酸类化合物含量的方法十分重要。目前，大麦籽粒中酚酸类化合物的测定方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳、 薄层色谱法、气相色谱法等。毛细管电泳重现性差，薄层色谱操作复杂且灵敏度较低，气相色谱检测酚酸类化合物需要进行衍生化处理，而高效液相色谱法操作简单、重现性好、灵敏度高、准确度高，在大麦籽粒中酚酸类化合物的检测中应用最为广泛。但是以往大多数高效液相色谱法分析的大麦籽粒酚酸类化合物成分均较少，而当所分析的成分较多时，往往分析条件复杂，分析时间较长，从而使分析成本大大增加，不利于大批量样品的测定。因此，有必要建立一种简单、快速、测定酚酸种类齐全的大麦籽粒中酚酸类化合物的测定方法，以利于生产企业的原料质量评价。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法准确、简便、灵敏度高、选择性、重复性好、快速，可以满足生产中对大麦籽粒中酚酸类化合物进行大批量快速测定和评价的基本要求，适用于任何大麦品种的酚酸类化合物的定量测定方法。本发明主要分析方法步骤如下 1、样品预处理
大麦籽粒烘干，粉碎，精确称取一定量粉碎后的大麦粉，按液固比40:广60:1加入浓度为4(Γ95%用0. 2NHC1调节PH值至4. 2的甲醇水溶液，并加入重量为大麦粉样品重量的 1/10^1/20抗坏血酸作为抗氧化剂，在超声频率25 85ΚΗζ、超声功率30(Γ60(Μ、5(Γ75τ条件下提取3(T50min，然后迅速冰浴以终止酸解，4000^5000g离心，上清液旋转蒸发至近干， 残余物用甲醇溶解，1500(Tl8000g离心，上清液于棕色容量瓶中定容，进样前用微孔滤膜过滤；
2、色谱条件
(1)色谱柱以高纯硅胶为填充剂的反相C18色谱柱；
(2)检测器紫外检测器；
(3)检测波长270-280nm;
(4)流动相采用甲醇一甲酸水溶液做为流动相，流动相A为100%甲醇，流动相B为浓度0. 1%-2%甲酸水溶液，HPLC分析前经真空脱气，采用梯度洗脱，洗脱程序为0-20min， 25%-50%B ；20-22min,50%-25%B ；22-27min,25%B ；
(5)流速:0.6 0. 8mL/min ；
(6)柱温4(T50°C；
3、浓度计算方法
用酚酸类化合物标准品，包括没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、间羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、邻香豆酸和水杨酸等13种配制成一定梯度浓度的混合标准溶液，取5 20 μ 1进样，按外标法，以峰面积-浓度做线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和测得的样品提取液中酚酸类化合物的峰面积计算样品提取液中酚酸类化合物的浓度；
4、样品检测
(1)按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品提取液广20μ1进样，为保证根据保留时间定性的准确性，可在每一批次样品检测的过程中取5 20μ 1 —定浓度的混合标准品溶液一起进样；
(2)按照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品提取液和混合标准品的色谱图，将样品提取液色谱图和同一批次检测的混合标准品色谱图进行比较，样品提取液色谱图中与标准品保留时间相近误差范围标准品保留时间士0. 5min的色谱峰即为相应的酚酸类化合物成分；
(3)将样品提取液中酚酸类化合物各成分的色谱峰面积代入3中的线性回归方程中， 计算样品提取液中酚酸类化合物各成分的浓度；
5、大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分含量的计算
通过以下公式计算大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量
权利要求
1. 一种大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，其特征在于主要测定方法步骤如下一、样品预处理大麦籽粒烘干，粉碎，精确称取一定量粉碎后的大麦粉，按液固比40:广60:1加入浓度为4(Γ95%用0. 2NHC1调节PH值至4. 2的甲醇水溶液，并加入重量为大麦粉样品重量的 1/10^1/20抗坏血酸作为抗氧化剂，在超声频率25 85ΚΗζ、超声功率30(Γ60(Μ、5(Γ75τ条件下提取3(T50min，然后迅速冰浴以终止酸解，400(T5(KK)g离心，上清液旋转蒸发至近干， 残余物用甲醇溶解，1500(Tl8000g离心，上清液于棕色容量瓶中定容，进样前用微孔滤膜过滤；二、色谱条件(1)色谱柱以高纯硅胶为填充剂的反相C18色谱柱；(2)检测器紫外检测器；(3)检测波长270-280nm;(4)流动相采用甲醇一甲酸水溶液做为流动相，流动相A为100%甲醇，流动相B为浓度0. 1%-2%甲酸水溶液，HPLC分析前经真空脱气，采用梯度洗脱，洗脱程序为0-20min， 25%-50%B ；20-22min,50%-25%B ；22-27min,25%B ；(5)流速:0.6 0. 8mL/min ；(6)柱温:40^500C；三、浓度计算方法用酚酸类化合物标准品，包括没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、间羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、藜芦酸、邻香豆酸和水杨酸等13种配制成一定梯度浓度的混合标准溶液，取5 20 μ 1进样，按外标法，以峰面积-浓度做线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和测得的样品提取液中酚酸类化合物的峰面积计算样品提取液中酚酸类化合物的浓度；四、样品检测(1)按照1中的方法进行样品预处理，取处理好的样品提取液5 20μ1进样；(2)按照2中的色谱条件进行检测，分别得到样品提取液和混合标准品的色谱图，将样品提取液色谱图和同一批次检测的混合标准品色谱图进行比较，样品提取液色谱图中与标准品保留时间相近误差范围标准品保留时间士0. 5min的色谱峰即为相应的酚酸类化合物成分；(3)将样品提取液中酚酸类化合物各成分的色谱峰面积代入3中的线性回归方程中， 计算样品提取液中酚酸类化合物各成分的浓度；五、大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分含量的计算通过以下公式计算大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量W = C×V/m×1000 式中W—大麦籽粒样品中酚酸类化合物成分的含量，mg/kg ；C一样品提取液中酚酸类化合物成分的浓度，mg/mL ；V—样品提取液的最终定容体积，mL ； m—大麦籽粒样品重量，g。
2.如权利要求1所述的大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，其特征在于所述的样品预处理中所用的超声频率为45 50KHz。
3.如权利要求1或2所述的大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，其特征在于所述的样品预处理中所用的超声功率为50(T550W。
全文摘要
一种大麦籽粒中酚酸类化合物的定量测定方法，本发明针对酚酸的理化性质采用一定浓度的甲醇水溶液提取大麦籽粒中的酚酸类化合物，然后将提取液离心、浓缩、过滤，取制备好的样品提取液上机，用甲醇—甲酸水溶液进行洗脱分离。本发明的分析方法准确、简便，灵敏度高，选择性、重复性好，在一次性测定大麦籽粒中酚酸类化合物的种类上比较全面，而且分析时间与以往方法相比大大缩短，可以满足生产中对大麦籽粒中酚酸类化合物进行大批量快速测定和评价的基本要求，适用于任何大麦品种的籽粒。
文档编号G01N30/89GK102426211SQ20111026450
公开日2012年4月25日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年7月20日
发明者王祥军, 齐军仓 申请人:石河子大学