专利名称：一种药物的指纹图谱及其测定方法
技术领域：
本发明涉及质量标准测定方法，具体涉及一种药物的指纹图谱及其测定方法。
背景技术：
一清胶囊是由汉代医学名著《金匮要略》中的“泻心汤”发展而来，其配方由大黄、黄芩、黄连组成，功用为泻火解毒、燥湿泄热，主治邪火内炽，迫血妄行，吐血，衄血，便秘溲赤；三焦积热，眼目赤肿，口舌生疮，外证疮疡，心胸烦闷，大便秘绪；湿热黄疸，胸中烦热痞满，舌苔黄腻，脉数实者。一清胶囊和颗粒是由根据该汉代处方发展而来，其中一清胶囊的功能主治:清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所致的身热烦躁、目赤口疮、咽喉牙龈肿痛、大便秘结、吐血、咯血、衄血、痔血；咽炎、扁桃体炎、牙龈炎见上述症候者。《中华人民共和国药典》(2005版)第一部401-402页记载了一清胶囊和颗粒的处方及制备工艺。其中一清胶囊的处方为:黄连660g、大黄2000g、黄芩IOOOg ;制法为:以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次I小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。含量测定为:本品每粒含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计,不得少于30.0mg ;含大黄以大黄素(C15HltlO5)和大黄酚(C15H10O4)的总量计，不得少于0.70mg。《中国药典》2010年版规定黄芩药材含黄芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%，黄芩饮片不得少于8.0% ;大黄药材含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的总量不得少于1.5% (按《中国药典》2010年版含量测定项目方法，检测多批大黄药材结果大黄素和大黄酹约占上述5种成分总量的50%,即大黄含大黄素和大黄酹的总量不得少于0.75% )。按此计算，一清胶囊黄芩中有效成分黄芩苷的提取率只有40%左右，大黄中有效成分大黄素和大黄酚的提取率仅有5%左右。目前市场上存在一清产品由一清胶囊、一清颗粒以及一清软胶囊等等，制剂形式多样；而随着目前中药材的价格升高，使得降低药材量的一清新处方和工艺变为研究重点，如CN102178753A通过改变提取工艺，降低50% -95%的药材用量，来获得新组成的一清；同时由于野生药材资源的匮乏，人工大规模的种植大黄、黄芩和黄连也变为开发重点。鉴于目前市场上目前一清制剂形式的多样，配方的不同、提取方法不同以及药材本身的种植模式的改变，治疗效果也会存在一定的差异，因此，一清制剂的质量监控方法变得十分重要。目前，药典以及其他文献给出的一清质量监控方法，多采用薄层色谱法鉴别内容物，而对于含量多是以大黄中的大黄素和大黄酚，黄芩中的黄芩苷作为含量鉴定的标准。但是一清中大黄、黄芩和黄连中的每单个成分中均含有大量的其他成分，如大黄中主要的化学成分为蒽醌衍生物、苯基丁酮卩比喃葡萄糖，二苯乙烯、丹宁酸和萘衍生物等[W.Jin, Y.F.Wang,R.L.Ge，H.M.Shi, C.Q.Jia, P.F.Tu.Simultaneous analysis of multiple bioactiveconstituents in Rheum tanguticum Maxim, ex Balf.by high-performance liquidchromatography coupled to tandem mass spectrometry, Rapid Communications inMass Spectrometry，2007，21 (14):2351-2360.];黄芩的主要化学成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类物质，目前已报道的黄酮有60多种，主要以葡萄糖苷的形式存在[温华珍，肖盛元，王义明，罗国安.黄芩化学成分及炮制学研究，天然产物研究与开发，2004，16:575-580 ； J.Han, M.Ye, M.Xu, J.H.Sun，B.R.Wang, D.Gu0.Characterizationof flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquidchromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry,Journal of Chromatography B，2007，848:355-362 ；G.Z.Liu, J.Y.Ma, Y.Z.Chen,Q.Q.Tian，Y.Shen, X.S.Wang, B.Chen, S.Z.Ya0.1nvestigation of flavonoid profileof Scutellaria baicalensis Georgi by high performance liquid chromatographywith diode array detection and electrospray ion trap mass spectrometry,Journalof Chromatography A，2009，1216 (23):4809-4814.];黄连的主要活性成分为原小蘖碱、口引哚类生物减和喹啉酮生物减等[X.B.Luo，B.Chen, S.Z.Ya0.Simultaneous analysisof protoberberine， indolequinoline and quinolone alkaloids in coptis-evodiaherb couple and the Chinese herbal preparations by high-performance liquidchromatography-electrospray mass spectrometry，Talanta，2005，66(I):103-110]。因此如何更精确的监控一清制剂的质量标准成为了新的研究热点。随着中药现代化、国际化的不断发展，现代分析技术如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱(Ge)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、X光衍射法、毛细管电泳、分子生物技术以及其他分析方法不断在中药鉴定中药质控等方面的应用，建立了一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法即指纹图谱。目前，美国FDA，英国和印度草药典，德国药用植物学会，加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法；2000年第4季度我国下发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》率先要求中药注射剂推行指纹图谱的质控办法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。其次,这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。而一清制剂是由大黄、黄芩和黄连组成，属于汉代古方，通过改进后的制剂如胶囊、颗粒和软胶囊等的治疗效果也已经得到临床上充分印证，但是是否能保证药物的质量以及有效成分的含量，仅靠简单的大黄中大黄素和大黄酚和黄芩中黄芩苷的质控是不够的，要控制其疗效，必须对它的活性物质群进行控制，因此，现代手段指纹图谱的引入质控标准变得尤为重要。Juan Chen 等[Juan Chen, Yang Yang and Yan-Ping Shi, Simultaneousquantification of twelve active components in Yiqing granule byultra-performance liquid chromatography -application to quality control study,biomedical chromatography，2011，25 (9): 1045-4053]公开一种利用超高效液相色谱(UPLC)和光电二极管阵列(PDA)检测器来检测一清胶囊中的活性成分，共获得12种活性物质，其分别为小檗碱、巴马汀、药根碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄苳、黄苳素、汉黄苳苷和汉黄苳素。Haibin Qu等[Haibin Qu, Yanhong Ma, KeYu, YiyuCheng，Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，43:66-72]公开一种反相高效液相层析和二极管阵列(DAD)检测器来检测一清胶囊中的活性成分，共检测到8种活性物质，分别为黄连、芦荟、大黄素、大黄酸、大黄素、大黄、黄芩、黄芩素和汉黄芩素。但是以上检测方法获得指纹图谱，物质检测不全，难以全面的反映一清制剂中的物质成分，因此在质控过程中存在一定的缺陷。如何更好获得较全面的一清制剂的指纹图谱，以期更好的监控一清制剂的质量，从而获得质量可控、安全有效的药物变得十分重要。
发明内容
针对目前市场上黄芩提取物、大黄提取物和黄连提取物因来源、产地等不同从而造成一清制剂的质量难以监控的问题，本发明通过大量的实验研究，获得一种可以有效监控药物质量，从而保证药物安全有效的指纹图谱的检测方法。本发明一方面提供了一种药物指纹图谱的测定方法，该方法包括(a)供试品溶液的制备:取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加75%乙醇溶解、定容、过滤即得供试品；(b)色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A:乙腈；流动相B:0.1%甲酸和20mM醋酸铵水溶液，检测波长为254nm。(c)测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；其中所述的药物为大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物或上述三种提取物组成的中药制剂。上述指纹图谱的检测方法中供试品溶液的制备优选为精密称量药物置于50ml量瓶中，加入75 %乙醇约40ml，超声40min，加75 %乙醇至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得供试品；其中所述药物为黄连提取物0.09g、大黄提取物0.27g、黄芩提取物0.14g或中药制剂0.5g的一种。本发明涉及的中药制剂主要有大黄提取物、黄连提取物和黄芩提取物组成。该中药制剂的制备方法优选为黄连660g、大黄2000g、黄芩IOOOg ;制法为:以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次I小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。本发明还提供了一种将上述指纹图谱的检测方法与质谱仪联用的方法，具体为将由高效液相色谱仪的紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪进行物质测定；其中所述质谱仪检测条件优选为如下条件:电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；全扫描质量范围:100-1000amu ;二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响度强度最高的2个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev ;其中所述正离子模式检测条件更优选为如下条件:喷雾电压4.5kV:鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb ;毛细管温度:275°C，毛细管电压为25V ;所述负离子模式检测条件更优选为如下条件:喷雾电压4.5kV:鞘气为20arb,辅助气为5arb,吹扫气为2arb ;毛细管温度:275°C，毛细管电压为25V。上述药物指纹图谱的测定方法中所用的色谱柱优选为安捷伦(Agilent)的Eclipse PlusC18。上述检测方法中所述梯度洗脱的程序优选如下程序:
其中下述比例为体积比Omin时,流动相A:流动相B = 5: 955min时,流动相A:流动相B = 14: 8625min时，流动相A:流动相B = 20: 8050min时，流动相A:流动相B = 25: 7580min时，流动相A:流动相B = 60: 4085min时，流动相A:流动相B = 80: 2091min时，流动相A:流动相B = 80: 2092min时，流动相A:流动相B = 5: 95IOOmin 时，流动相 A:流动相 B = 5: 95 ；其中柱温为25_30°C，流速为1.0ml/min。本发明还进一步提供了大黄提取物的指纹图谱，其含有11个特征峰，分别为:I号峰为没食子酸4-0- β -D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟23号峰为大黄酚-1-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为51.0O分钟24号峰为大黄素-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.58分钟25号峰为大黄酚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.65分钟26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟28号峰为大黄素甲醚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为60.71分钟31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟。本发明还提供了黄连提取物得指纹图谱，其含有9个特征峰，分别为:3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟。本发明还提供了黄芩提取物的指纹图谱，其含有21个特征峰，分别为:4号峰为高黄芩素-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为15.04分钟5号峰为白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷平均保留时间为20.13分钟6号峰为白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖平均保留时间为22.98分钟7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟9号峰为异鼠李素-7-0-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟
10号峰为5，6- 二羟基-7-0-葡萄糖苷酸黄烷酮平均保留时间为29.61分钟11号峰为去甲汉黄芩素-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为31.34分钟12号峰为黄芩素-6-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为33.08分钟13号峰为5，7，3-三羟基_4_甲氧基黄酮平均保留时间为33.72分钟14号峰为木蝴蝶素A-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为34.03分钟19号峰为5，6，7_三羟基-8-甲氧基黄酮-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为37.17分钟20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟30号峰为黄芩素平均保留时间为62.5分钟32号峰为黄芩新素I平均保留时间为70.64分钟33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟35号峰为5,7-二轻基-6,8-二甲氧基黄酮平均保留时间为71.63分钟36号峰为黄芩新素II平均保留时间为72.31分钟37号峰为木蝴蝶素A平均保留时间为72.68分钟38号峰为5，2’ - 二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮平均保留时间为74.76分钟。本发明还进一步提供了由大黄提取物、黄连提取物和黄芩提取物组成的中药制剂得指纹图谱，其含有41个特征峰，分别为:I号峰为没食子酸4-0- β -D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟4号峰为高黄芩素-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为15.04分钟5号峰为白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷平均保留时间为20.13分钟6号峰为白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖平均保留时间为22.98分钟7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟9号峰为异鼠李素-7-0-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟10号峰为5，6- 二羟基-7-0-葡萄糖苷酸黄烷酮平均保留时间为29.61分钟11号峰为去甲汉黄芩素-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为31.34分钟12号峰为黄芩素-6-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为33.08分钟13号峰为5，7，3-三羟基_4_甲氧基黄酮平均保留时间为33.72分钟14号峰为木蝴蝶素Α-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为34.03分钟15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟19号峰为5，6，7_三羟基-8-甲氧基黄酮-7-0-葡萄糖苷酸平均保留时间为37.17分钟
20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟23号峰为大黄酚-1-0--D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为51.00分钟24号峰为大黄素-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.58分钟25号峰为大黄酚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.65分钟26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟28号峰为大黄素甲醚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为60.71分钟29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟30号峰为黄芩素平均保留时间为62.50分钟31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟32号峰为黄芩新素I平均保留时间为70.64分钟33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟35号峰为5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮平均保留时间为71.63分钟36号峰为黄芩新素II平均保留时间为72.31分钟37号峰为木蝴蝶素A平均保留时间为72.68分钟38号峰为5，2’- 二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮平均保留时间为74.76分钟39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟本发明通过液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法鉴定一清胶囊中的化学成分，通过将色谱峰的保留时间和质谱图，与对照品或文献进行对比，对41个色谱峰进行了归属和鉴定，其中有8个化合物通过与对照品保留时间进行对照，结构得到确证，被鉴定的化合物结构如下。
权利要求
1.一种药物指纹图谱的测定方法，其特征在于包含 (a)供试品溶液的制备:取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加乙醇溶解、定容、过滤即得供试品； (b)色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A:乙腈；流动相B:0.1%甲酸和20mM醋酸铵水溶液；检测波长为254nm ； (c)测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱； 其中所述的药物为大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物或上述三种提取物组成的中药制剂。
2.根据权利要求1任一项所述药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述供试品溶液的制备方法如下:精密称量药物置于50ml量瓶中，加入75%乙醇约40ml，超声40min，加75%乙醇至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得供试品；其中所述药物为黄连提取物0.09g、大黄提取物0.27g、黄芩提取物0.14g或中药制剂0.5g的一种。
3.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述中药制剂的制备方法为黄连660g、大黄2000g、黄芩IOOOg ;制法为:以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次I小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。
4.根据权利要求1-4中任一项所述药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱仪的紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪进行物质测定。
5.根据权利要求5所述药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述质谱仪检测条件如下:电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；全扫描质量范围:100-1000amu ;二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响度强度最高的2个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。
6.根据权利要求6所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述正离子模式检测条件:喷雾电压4.5kV:鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb ;毛细管温度:275°C，毛细管电压为25V ;所述负离子模式检测条件:喷雾电压4.5kV:鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb ;毛细管温度:275°C，毛细管电压为25V。
7.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述的色谱柱为安捷伦的 Eclipse Plus C18。
8.根据权利要求7所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述梯度洗脱的程序如下:其中下述比例为体积比 Omin时,流动相A:流动相B = 5: 95 5min时,流动相A:流动相B = 14: 86 25min时，流动相A:流动相B = 20: 80 50min时,流动相A:流动相B = 25: 75 80min时,流动相A:流动相B = 60: 40 85min时，流动相A:流动相B = 80: 20 91min时,流动相A:流动相B = 80: 2092min时,流动相A:流动相B = 5: 95 IOOmin时,流动相A:流动相B = 5: 95 ； 其中柱温为25-30°C，流速为1.0ml/min。
9.根据权利要求1-8所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为大黄提取物时，其指纹图谱中含有11个特征峰，分别为: I号峰为没食子酸4-0-β -D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟 2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟 23号峰为大黄酚-1-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为51.0O分钟 24号峰为大黄素-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.58分钟 25号峰为大黄酚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.65分钟 26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟 28号峰为大黄素甲醚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为60.71分钟 31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟 39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟 40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟 41号峰为大黄素甲 醚平均保留时间为88.20分钟。
10.根据权利要求1-8所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为黄连提取物时，其指纹图谱中含有9个特征峰，分别为: 3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟 8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟 15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟 16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟 17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟 18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟 21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟 22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟 27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟。
11.根据权利要求1-8所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为黄芩提取物时，其指纹图谱中含有21个特征峰，分别为: 4号峰为高黄芩素-7-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为15.04分钟 5号峰为白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷平均保留时间为20.13分钟 6号峰为白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖平均保留时间为22.98分钟 7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟 9号峰为异鼠李素-7-0-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟 10号峰为5，6- 二羟基-7-0-葡萄糖酸黄烷酮平均保留时间为29.61分钟 11号峰为去甲汉黄芩素-7-0-葡萄糖醛酸甙平均保留时间为31.34分钟 12号峰为黄芩素-6-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为33.08分钟 13号峰为5，7，3-三羟基-4-甲氧基黄酮平均保留时间为33.72分钟 14号峰为木蝴蝶素Α-7-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为34.03分钟19号峰为5，6，7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为37.17分钟 20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟 29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟 30号峰为黄芩素平均保留时间为62.5分钟 32号峰为黄芩新素I平均保留时间为70.64分钟 33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟 34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟 35号峰为5，7- 二羟基_6，8- 二甲氧基黄酮平均保留时间为71.63分钟 36号峰为黄芩新素II平均保留时间为72.31分钟 37号峰为木蝴蝶素A平均保留时间为72.68分钟 38号峰为5，2’ - 二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮平均保留时间为74.76分钟。
12.根据权利要求1-8所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为由大黄提取物、黄连提取物和黄芩提取物组成的中药制剂时，其指纹图谱中含有41个特征峰，分别为: I号峰为没食子酸4 -0-β -D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟 2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟 3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟 4号峰为高黄芩素-7-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为15.04分钟 5号峰为白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷平均保留时间为20.13分钟 6号峰为白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖平均保留时间为22.98分钟 7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟 8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟 9号峰为异鼠李素-7-0-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟 10号峰为5，6- 二羟基-7-0-葡萄糖酸黄烷酮平均保留时间为29.61分钟 11号峰为去甲汉黄芩素-7-0-葡萄糖醛酸甙平均保留时间为31.34分钟 12号峰为黄芩素-6-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为33.08分钟 13号峰为5，7，3-三羟基-4-甲氧基黄酮平均保留时间为33.72分钟 14号峰为木蝴蝶素Α-7-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为34.03分钟 15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟 16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟 17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟 18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟 19号峰为5，6，7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-0-葡萄糖酸苷平均保留时间为37.17分钟 20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟 21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟 22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟 23号峰为大黄酚-1-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为51.00分钟24号峰为大黄素-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.58分钟25号峰为大黄酚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.65分钟26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟28号峰为大黄素甲醚-8-0-β -D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为60.71分钟29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟30号峰为黄芩素平均保留时间为62.5分钟31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟32号峰为黄芩新素I平均保留时间为70.64分钟33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟35号峰为5，7- 二羟基_6，8- 二甲氧基黄酮平均保留时间为71.63分钟36号峰为黄芩新素II平均保留时间为72.31分钟37号峰为木蝴蝶素A平均保留时间为72.68分钟38号峰为5，2’ - 二羟基 _6，7，8-三甲氧基黄酮平均保留时间为74.76分钟39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟。
全文摘要
本发明涉及一种药物指纹图谱的测定方法，具体涉及大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物和上述三种药物组成的药物制剂的指纹图谱的测定方法，本发明中供试品溶液的制备取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加乙醇溶解、定容、过滤即得供试品；色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A乙腈；流动相B0.1％甲酸和20mM醋酸铵水溶液；检测波长为254nm；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明获得指纹图谱检测方法可重复性高、物质检测全面，且能直接与质谱仪联用，具有很好的药物监控效果。
文档编号G01N30/88GK103163260SQ20111042271
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者邬智刚, 朱小兰, 柯潇 申请人:成都康弘制药有限公司