专利名称：检测三聚氰胺的化学发光试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测领域，具体地，本发明提供了一种三聚氰胺的化学发光定量测定试剂盒的制备方法。
背景技术：
食品安全检测是依据国家有关标准，评价食品质量、判断优劣的主要手段，为食品安全监管工作提供重要的技术支撑。随着国家对食品安全的日益重视，食品安全检测也在逐步发展中。化学发光免疫分析(CLIA)是将具有高灵敏度的酶催化发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，用以检测抗原的分析技术。化学发光是近十年来在国内外最流行的免疫检测技术，其灵敏度、准确性均要高于传统的酶联免疫分析技术。三聚氰胺(Melamine)是一种低毒、无味的纯白色单斜棱晶体，形似蛋白粉，属于三嗪类含氮杂环有机化合物，广泛应用于塑料、染料、化肥的生产和纺织行业。由于三聚氰胺分子含氮量高达66%，只要添加到食品或饲料中就可在检测中造成蛋白质含量较高的假象。 目前在饲料、牛奶、奶粉、饼干、奶糖等相关产品均发现有三聚氰胺残留现象。动物实验结果表明，三聚氰胺的摄入可能会导致繁殖障碍、膀胱炎、慢性肾炎、肾结石、甚至膀胱癌。因此， 食品安全领域需要高精密度与灵敏度的三聚氰胺检测方法。目前三聚氰胺的检测方法主要采用气相色谱-质谱联用、液相色谱等物理方法， 以及胶体金、酶联免疫等生化方法。色谱与质谱方法需要昂贵的仪器与复杂的操作，不适合现场监控与大量样品的筛查。免疫生化方法具有简便、快速的特点，但精密性与重复性存在缺陷。胶体金方法灵敏度低，精密度差，尚不能进行定量测定。酶联免疫方法可以进行定量测定，但精密性、灵敏度仍存在一定的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测三聚氰胺的化学发光试剂盒，具有简便、快速、灵敏、精密性好的特点。制备上述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。本发明所提供的化学发光方法检测三聚氰胺的试剂盒，采取以下两种可实现的模式中的任何一种
I)采取三聚氰胺包被载体，酶标记的抗抗体为酶标志物。包被抗原与样本中的抗原竞争结合抗三聚氰胺抗体，酶标志物则结合在抗三聚氰胺抗体上。最后形成的[包被抗原-抗三聚氰胺抗体-酶标记抗抗体]复合物数量与样本中的抗原数量成反比例。2)采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物。酶标志物与样本中的抗原竞争结合抗三聚氰胺抗体，再被包被抗抗体捕获，最后形成的[包被抗抗体-抗体-酶标记三聚氰胺]复合物数量与样本中的抗原数量成反比例。所述的抗体可以为单克隆抗体即鼠抗三聚氰胺，也可为多克隆抗体即兔或羊抗三聚氰胺。针对鼠抗体的抗抗体可为兔抗鼠、羊抗鼠，针对兔抗体的抗抗体可为羊抗兔、驴抗兔，针对羊抗体的抗抗体可为驴抗羊。所述的化学发光试剂盒还包括三聚氰胺校准品、上述酶作用的化学发光底物、浓缩洗涤液。其中，所述化学发光底物可以为1，2_ 二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2_ 二氧乙烷类衍生物可以为(金刚烷)-1，2_ 二氧乙烷、3-(2’_螺旋金刚烷)-4-甲氧基_4_ (3” -憐酸氧基)苯基_1，2_ _■氧乙烧(AMPF*D)。其中，所述浓缩洗涤液可以为PH值7. O 8. O的磷酸盐缓冲液，可以含有1% 2% 的吐温-20，O. 05 O. 1%的叠氮化钠。进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤
O以三聚氰胺纯品配制三聚氰胺校准品；
2)以三聚氰胺或抗抗体包被载体；
3)以酶标记抗抗体或三聚氰胺；
4)稀释酶标志物、抗体至应用浓度；
5)分装以及组装试剂盒；
在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体为固相载体，可以为微孔板、塑料珠、塑料管或磁珠。优选为微孔板。所述酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。化学发光方法的原理包括免疫竞争反应及发光反应。免疫竞争反应如前所述，样本中的抗原与系统中的抗原竞争结合限量抗体，样本中的抗原数量与最终被固相捕获的酶数量成反相关。发光反应是指酶催化发光底物，发射出单光子信号，可以通过单光子计数器进行检测。样本中的三聚氰胺的浓度是通过一条参考曲线(或称校准曲线)进行计算的。系列校准品含有不同浓度的三聚氰胺，检测后产生不同的单光子计数。在一定的浓度范围内，浓度与单光子计数之间符合Iogit-Iog或四参数曲线模型。根据样品的计数，可以从曲线推算出其浓度。使用本发明的试剂盒时，可以将校准品或样本、酶标志物、抗体一起加入固相载体中，经过30分钟的免疫反应，经洗涤除去未被固相载体捕获的部分，再加入发光底物，用单光计数仪进行测量。本发明的化学发光试剂盒与酶联免疫法相比，具有更高的灵敏度与精密性，并且没有酶免底物OPD、TMB的致癌作用，操作步骤上，减少了一步显色温育与中止，操作更为方便，时间也有所缩短。与胶体金相比，可以更准确地定量确定样品中的三聚氰胺含量高低。 具有更好的应用价值。另外，本试剂盒的主要试剂都是即开即用的液体形式，最大程度地方便了操作。
图I为三聚氰胺的结构式。图2为试剂盒加样及反应模式。图3为试剂盒组份图
其中1.系列校准品2.酶标志物3.抗体4.浓缩洗涤液5.预包被板6.底物A 7.底物B
图4为羊抗鼠包被微孔板，酶标记三聚氰胺组建试剂盒的标准曲线。图5为Melamine-BSA包被微孔板，酶标记羊抗鼠组建试剂盒的标准曲线。
具体实施例方式实施例I :采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒的制备与使用
一、采取抗抗体包被载体,酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒的检测原理试剂盒反应体系中加入的液体包括样本(可能含有三聚氰胺)、酶标记三聚氰胺、抗三聚氰胺抗体。抗三聚氰胺抗体能特异性地识别三聚氰胺，能结合样本中的三聚氰胺与酶标记的三聚氰胺。由于抗体是限量的，因而样本中的三聚氰胺数量越多，其结合的抗体也越多，相应地，与酶标记三聚氰胺结合的抗体就越少。这种现象称为竞争反应。固相载体上的抗抗体能捕获抗体，最终在固相载体表面形成抗抗体-抗三聚氰胺抗体-样本三聚氰胺或抗抗体-抗三聚氰胺抗体-酶标记三聚氰胺两种复合物。其中后者与样本中的三聚氰胺数量成反相关的关系。洗涤除去未捕获的液体，加入发光底物，在酶的催化作用下发射光子。光子数量取决于被结合的酶标记三聚氰胺，因而与样本中的三聚氰胺反相关。用一定浓度的三聚氰胺校准品可以得出一条随浓度增加而发射光子数量减少的曲线， 根据样本的发光值可以从曲线上推导其浓度。二、采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒一般可以包括
I、包被有抗抗体的固相载体，包被浓度可以从5mg/ml 20mg/ml。2、酶标志物工作液，三聚氰胺与酶的偶联物，用稀释液稀释至工作浓度。稀释液一般包括O. OIM O. 02M磷酸盐缓冲液，PH值7. O 8. 0，O. 5 1%的牛血清白蛋白。3、抗三聚氰胺抗体工作液，可以为兔抗三聚氰胺多克隆抗体，也可以为鼠抗三聚氰胺单克隆抗体。用稀释液稀释至工作浓度。稀释液一般包括O. 01Μ 0. 02M磷酸盐缓冲液， PH值7. O 8. 0,0. 5 1%的牛血清白蛋白。4、三聚氰胺校准品，浓度分别为0、3、10、30、100、300ng/ml，配制标准品的稀释液为5 10% 二甲基甲酰胺，O. 05 O. IM磷酸盐缓冲液，PH7. O 8. O。5、发光底物液，由A液与B液组成。A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为异鲁米诺或鲁米诺。6、浓缩洗涤液，PH值7. O 8.0，I :20稀释后使用。稀释后的洗涤液含有O. OlM
O.02M磷酸盐缓冲液，PH值7. O 8. 0，O. 05 O. 1%的吐温20。三、采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒的具体组成及其制备
I、包被有抗抗体的固相载体
原料10mg/ml的羊抗鼠IgG
稀释液0. OlM磷酸盐缓冲液(PB)，pH7. 2
封闭液0. OlM磷酸盐缓冲液(PB)，ρΗ7· 2，1%牛血清白蛋白。配制方法原料按I :500稀释，混匀，静置30分钟以达到平衡，称为包被液。按每孔IOOml等体积加入发光微孔板的各孔中，4°C放置24小时。弃去包被液，用O. OlM磷酸盐缓冲液，PH7. 2加满各孔，静置I分钟，弃去，再加入等体积的封闭液，4°C放置24小时。弃去封闭液，真空抽干，用铝箔袋真空密封后可长期保存。2、酶标志物工作液
原料三聚氰胺-辣根过氧化物酶偶联物(Melamine-HRP),浓度lmg/ml。稀释液0.OlM PB,O. 5% BSA, pH7. 2,0. l%Proclin_300 配制方法原料按I :5000稀释，混匀，按7ml/瓶分装备用。3、抗三聚氰胺抗体工作液原料抗三聚氰胺单克隆抗体
稀释液0. OlM PB, O. 5% BSA, pH7. 2,0. l%Proclin-300 配制方法原料按I :2000稀释，混匀，按7ml/瓶分装备用。4、三聚氰胺校准品
原料三聚氰胺纯品，用二甲基甲酰胺溶解配制为lmg/ml。稀释液10% 二甲基甲酰胺，O. IM磷酸盐缓冲液，PH7. 2。配制方法原料分别按I :333333,1 :100000,1 :33333,1 :10000,1 :3333 稀释，配制为系列校准品，浓度分别为3、10、30、100、300ng/ml。以稀释液为Ong/ml。5、发光底物液A，发光底物液B :分别含3mmol/L的过氧化氢与2mmol/L的鲁米诺。6、浓缩洗涤液配制O. 2M磷酸盐缓冲液，PH7. 2，3%Tween-20,按15ml/瓶进行分装。使用前按照I :20进行稀释为洗涤液工作液。四、检测操作过程
I.向微孔板各孔中加入50ml三聚氰胺校准品或待测样本。2.向微孔板各孔中加入50ml酶标志物(三聚氰胺-辣根过氧化物酶偶联物)。3.向微孔板各孔中加入50ml抗体(抗三聚氰胺单克隆抗体)。4.将微孔板室温振荡反应30分钟。5.吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，每次I分钟，末次洗板后将板拍干。6.各孔中加入50ml底物液A与50ml底物液B。7.将微孔板放入化学发光仪上检测各孔发光值。五、数据处理
I、联机处理由电脑自动处理得出结果。可以使用Iogit-Iog数据处理模式。拟合方程为logit(Y) =Alog(X)+B，Y为光子计数，X为浓度。A，B为直线参数。A 代表斜率，B代表截距。Iogit计算各校准品管或样本管的Iogit值计算公式如下Iogit= ( B/BO)/ (I一 B/BO)。其中B/BO为百分结合率。百分结合率计算设O校准管计数为BO,各校准品管或样本管计数为B,则百分结合率=B/B0X100%。2、测定实例如下表
校准品XSOSl=3S2=10S3=30S4=100S5=300Sample复孔I121260092880958229835420818067192678380541复孔2141952094175263512834480718514399602368211B/BO-71. 1%46. 3%26. 6%13. 9%7. 3%28. 4%
计算后的拟合方程为=Iogit(Y)= — 1.71Log(X)+1.62曲线相关系数R=O. 9979,计算sample测值为30. 5ng/ml。 3、准确性试验
在奶粉样本中添加三聚氰胺浓品，添加后使样本中三聚氰胺浓度增加分别为10ng/ml、 50ng/ml、200ng/ml，添加体积为5%。未添加样本加入同等体积稀释液作为空白对照。双孔测定含添加前后的样本浓度，结果如下表
权利要求
1.一种检测三聚氰胺的化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括三聚氰胺校准品；包括有三聚氰胺或抗抗体的载体；酶标记的抗抗体或三聚氰胺；抗三聚氰胺抗体；上述酶作用的化学发光底物。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为固相载体。
3.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁珠。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺， (金刚烧)_1，2_ 二氧乙烧、3_ (2’-螺旋金刚烧)_4_甲氧基_4_ (3”_憐酸氧基)苯基-I, 2- 二氧乙烷(AMPPD)。
6.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，载体包被三聚氰胺时，酶标志物使用酶标记抗抗体，载体包被抗抗体时，酶标志物使用酶标记的三聚氰胺。
7.一种制备权利要求I所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤以三聚氰胺纯品配制三聚氰胺校准品；以三聚氰胺或抗抗体包被载体；以酶标记抗抗体或三聚氰胺；稀释酶标志物、抗体至应用浓度；分装以及组装试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种检测三聚氰胺的化学发光试剂盒及其制备方法。本发明所提供的化学发光方法检测三聚氰胺的试剂盒，可以采取三聚氰胺包被载体，酶标记的抗抗体为酶标志物,也可以采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物。试剂盒还包括三聚氰胺校准品、上述酶作用的化学发光底物、浓缩洗涤液。本发明的化学发光试剂盒与酶联免疫法相比，具有更高的灵敏度与精密性，并且没有酶免底物OPD、TMB的致癌作用，操作步骤上，减少了一步显色温育与中止，操作更为方便，时间也有所缩短。与胶体金相比，可以更准确地定量确定样品中的三聚氰胺含量高低，具有更好的应用价值。另外，本试剂盒的主要试剂都是即开即用的液体形式，最大程度地方便了操作。
文档编号G01N21/76GK102590495SQ20121002987
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者张恂, 郑嘉庚 申请人:北京沙屏研科技有限公司