专利名称：一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法
技术领域：
本发明涉及化工、食品、环境、生物等行业的拉曼光谱仪器分析和检测领域，特别是一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法。
背景技术：
拉曼光谱属于分子振动光谱，反映分子的特征结构，可以用于包括固体、液体、气体等的样品的分析和检测。然而拉曼散射效应是一个非常弱的过程(一般仅为入射光强的10-1°)，使其应用受到很大的局限。Fleischman等人于1974年首次获得吸附在粗糙的银电极表面上的单分子层吡啶分子的高质量拉曼光谱，从而发现了表面增强拉曼光谱效应。近三十多年来，利用了金或者银材料的纳米增强技术的表面增强拉曼光谱(SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy, SERS)技术的发明将拉曼光谱检测灵敏度提高了百万倍，使传统的拉曼光谱技术具备了超高的灵敏度，因而其应用领域得到了一定的拓展。作为一 种分析检测技术，SERS具有很多优点，例如1)拉曼光谱的谱峰窄、具有高度的分子特征性；2)很少受光漂白的影响；3)检测灵敏度高。因此，尽管目前SERS增强机理的解释尚未达成完全共识，SERS技术在细胞、生物大分子的组成鉴定与结构表征、生物分子之间的相互作用、以及生物组织的体外和活体检测中已有诸多应用。SERS技术的核心就是拉曼增强基底。拉曼增强基底目前主要有表面粗糙的金、银、铜等少数金属电极、各类金属纳米粒子组成的溶胶、金属沉积岛膜等。其中，由金、银纳米粒子组成的溶胶型拉曼增强试剂因其制备相对较简单、增强效果好、以及适用于细胞内生物分子的检测等优点而广泛用于生物分析领域中SERS检测的基底。但是SERS技术所存在的缺点如其优点一样突出。由于SERS信号的获得依赖于纳米级粗糙的金属基底(如纳米银或金胶体)，因此SERS光谱的绝对强度不但取决于待测物质的浓度，而且与SERS基底的物理性质(如纳米银或金胶体的粒径大小、形状以及聚集度等)以及激光光源功率和聚焦位置有关。而作为SERS基底主要组成的银(金)纳米粒子的可重现性和稳定性均较差，严重影响SERS信号的可靠性和重现性，导致SERS定量分析结果的准确度远远达不到实际分析的要求。虽然已有一些将SERS技术用于定量分析的尝试，但目前SERS技术仅属于定性或半定量分析技术，尚未成为一项成熟的定量分析检测技术。SERS技术的这一缺陷大大削弱了其高检测灵敏度所带来的技术优势，从而严重限制了SERS技术的推广应用和相关仪器的市场开发。因此在现阶段，如何提高SERS定量分析结果的精确度及其成熟的应用技术，将成为SERS技术开发与应用的核心内容。在文献中，目前主要采用以下三种途径来提高SERS定量分析结果的准确度1)提高SERS基底的制作技术和工艺，尽量减小SERS基底之间的差异。国际上在提高SERS定量分析结果精确度的工作主要集中在这一方面。然而制作各项物理性质指标高度一致、且性质稳定的SERS基底(特别是银或金纳米溶胶)是一项十分艰巨的任务。目前尚没有一项制作技术能保证制备出的SERS基底物理性质完全一致。因此依靠制作完全一致的SERS基底来达到实现SERS准确定量分析的目的至少在目前是不太现实的。2)采用内标法结合微流控技术可在一定程度上消除SERS基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的不同对SERS定量分析结果精确度的影响。采用内标法时，要求内标必须具有与待测样本中所有组分的SERS光谱峰均不重叠的峰，而且所测得的SERS光谱中不能有显著的背景干扰。显然，采用SERS技术对不同的体系进行定量分析时，需要采用不同的内标。对于复杂的体系(如细胞内蛋白质的定量分析)来说，通常很难找到合适的内标。这在很大程度上限制了内标法的广泛应用。3)另外，采用多元数据分析方法如偏最小二乘回归法(Partial LeastSquares, PLS)等取代传统的建立在峰高或峰面积基础上的单变量数据分析法，在一定程度上也能提高SERS定量分析结果的精确度。但是由于PLS等模型并没有明确地阐明SERS基底物理性质变化与待测物质SERS信号强度变化之间的定量关系，因而不能有效地消除SERS基底之间的差异对SERS定量分析结果的影响，所获得的定量结果通常也达不到实际分析的要求。如上所述，现有用于提高SERS定量分析结果精确度的方法和途径有着各种局限性和不足，致使SERS技术很少用于复杂体系的准确定量分析。既然目前不太可能获得各项 物理性质指标高度一致且性质稳定的SERS基底，那么为了实现应用SERS技术对复杂体系进行准确的定量分析，必须发展新型的方法来将待测物质浓度变化所引起SERS信号贡献与SERS基底物理性质变化所带来的SERS信号贡献分离开来，从而消除SERS基底物理性质变化对SERS定量分析结果的影响，实现复杂体系的SERS准确定量分析。迄今为止国内外尚未出现能有效解决这一问题的理论和方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，将待测物质浓度变化所引起SERS信号贡献与SERS基底物理性质变化对样本SERS信号的乘子效应影响进行有效分离，以解决复杂化学生物体系的SERS光谱准确定量分析问题。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(I)在纳米粒子上标记适量的内标物质，得到具有准确定量功能的表面增强拉曼光谱基底，其中内标物质在纳米粒子上的覆盖率小于100% ；(2)采用上述定量表面增强拉曼光谱基底对校正样本集中待测物质进行表面增强拉曼光谱分析检测，获得所有校正样本集的表面增强拉曼光谱数据，并建立新型表面增强拉曼光谱定量分析模型，即乘子效应模型；(3)利用校正样本集表面增强拉曼光谱数据Xeal和校正样本集中待测化学组分的浓度矢量c来估计校正样本集的表面增强拉曼光谱信号中由于表面增强拉曼光谱基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化而导致的乘子效应矢量b ；(4)测得未知待测样本的表面增强拉曼光谱信号Xun，然后采用‘双校正’策略消除未知待测样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应，并实现对未知待测样本中待测物质浓度的准确预测。(I)样本SERS光谱信号的新型分解模型当使用银(金)纳米溶胶作为SERS基底对待测物质进行SERS定量分析时，银(金)纳米粒子的粒径大小、形状、以及聚集度等物理性质的变化均对待测物质的SERS信号强度有十分显著的影响(见图2)。另外，激光光源的功率和聚焦位置的变化也会显著地影响待测物质的SERS信号强度。而在使用SERS技术对待测物质进行定量分析时，很难(甚至是不可能)保证每次检测所用的SERS基底的物理性质和激光光源的聚焦位置完全一样。因此所获得的SERS光谱信号不但包含了待测物质浓度变化的SERS信号强度贡献，而且还包含有SERS基底物理性质和激光光源聚焦位置变化的SERS信号强度贡献Ik(V)=Ck rchem(v) gphys,k ginstrum，k I0，k+dk(v)(I)其中，Ik(V)代表第k个样本(或第k次测量)在拉曼位移V处的SERS信号强度；Ck代表第k个样本中待测物质的浓度^ctol(V)代表第j个化学组分在单位浓度下的表面增强拉曼光谱信号强度，取决于待测物质分子在拉曼位移V处的散射性质；gphys，k代表SERS基底物理性质变化对第k个样本SERS信号强度的乘子效应影响部分；ginstram，k代表光谱仪器的整体响应特性以及激光光源聚焦位置对第k个样本SERS信号的乘子效应影响；1。，，为第 k次测量时入射激光强度；dk(v)代表在拉曼位移V处的背景干扰以及SERS基底物理性质变化对第k个样本SERS信号的非乘子效应影响部分。式⑴中只有在分析测量中保持相对不变，其他各项则随着SERS基底物理性质和激光光源聚焦位置和功率的变化而变化。当只有一个物质(即待测物质)在SERS基底表面有增强效应、产生SERS信号时，显然无法将gphys，k、gins_，k和Icu的变化对样本SERS信号总强度的贡献与待测物质浓度Ck的变化所带来的SERS信号强度贡献区分开来。这正是SERS技术难以用于准确定量分析的根本原因。目前，人们主要采用内标法来提高SERS定量分析结果的精确度。内标法的原理很简单首先选择具有与待测物质SERS光谱峰不重叠的光谱峰的物质做内标，将其加入待测溶液或修饰在SERS基底上，然后将待测物质的SERS光谱峰的峰高(或峰面积)除以内标所独有光谱峰的峰高(或峰面积)来消除gphys，k、gins_，k和Icu的变化对SERS定量分析结果的影响。显然，采用内标法对不同的待测物质进行SERS定量分析时，通常需选用不同的内标，以满足内标具有与待测物质SERS光谱峰不重叠的光谱峰这一严苛要求；此外，普通内标法的使用还要求样本SERS信号中不存在显著的背景干扰。在很多情况下，要找到一个合适的内标是一件很不容易的事。因此普通内标法难以作为一个普适性的SERS定量分析方法而加以推广。(2)新型SERS光谱定量分析模型设现有K个校正样本，这些校正样本中有J(J ^ 2)个化学组分能在SERS基底表面上产生SERS信号(任意假定校正样本中第I个组分是人工加入到样本中的内标组分；在所有样本中，该组分的浓度是已知的)；且SERS基底物理性质以及激光光源聚焦位置的变化对各个化学组分SERS信号的乘子效应基本相同，则第k个样本在拉曼位移V处的SERS光谱强度Ik(V)可分解为
J
h(v) = K4 ■ Vchemx(V) + ZcKj Tchem j(V)} gphys—k ■ g,咖Im_k IoJ( +dk(v)( 2 )
/=2其中，Clu代表第k个样本中第j个化学组分的浓度Jctenu(V)代表第j个化学组分分子在拉曼位移V处的散射性质。设现已获得K个校正样本的SERS光谱。假定在所考察的相对较窄的拉曼位移范围内(V i vn)，gphys，k和ginstram，k均不随拉曼位移V变化而变化，贝1J第k个校正样本在拉曼位移V I Vn范围内的拉曼光谱Xk=IiIk(V1), . . .，Ik(Vn)]可表
示为
权利要求
1.一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)在纳米粒子上标记适量的内标物质，得到具有准确定量功能的表面增强拉曼光谱基底，其中内标物质在纳米粒子上的覆盖率小于100% ； (2)采用上述定量表面增强拉曼光谱基底对校正样本集中待测物质进行表面增强拉曼光谱分析检测，获得所有校正样本集的表面增强拉曼光谱数据，并建立新型表面增强拉曼光谱定量分析模型，即乘子效应模型； (3)利用校正样本集表面增强拉曼光谱数据Xeal和校正样本集中待测化学组分的浓度矢量c来估计校正样本集的表面增强拉曼光谱信号中由于表面增强拉曼光谱基底物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化而导致的乘子效应矢量b ； (4)测得未知待测样本的表面增强拉曼光谱信号Xun，然后采用‘双校正’策略消除未知待测样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应，并实现对未知待测样本中待测物质浓度的准确预测。
2.根据权利要求I所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤(I)中，纳米粒子为银或者金纳米粒子；内标物质为对甲苯硫酚。
3.根据权利要求I所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中，乘子效应模型为 其中xk代表第k个样本的表面增强拉曼光谱；ctl代表第k个样本中内标组分的浓度；Ctj代表第k个样本中第j个化学组分的浓度代表第j个化学组分在单位浓度下的表面增强拉曼光谱信号强度，取决于第j个化学组分分子的散射性质；bk代表表面增强拉曼光谱基底物理性质、光谱仪器的整体响应特性以及激光光源功率和聚焦位置的变化对第k个样本表面增强拉曼光谱信号强度的乘子效应影响部分；dk代表背景干扰以及表面增强拉曼光谱基底物理性质变化对第k个样本表面增强拉曼光谱信号的非乘子效应影响部分。
4.根据权利要求I所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中，估计乘子效应矢量b的过程如下 .1)对校正样本集的表面增强拉曼光谱数据Xm1进行奇异值分解即 Xcal=USVT，其中U、S、V为对Xcal进行奇异值分解后得到的三个矩阵，上标‘T’代表矩阵转置操作;定义Uj为由U的前J列组成的矩阵，其中J为校正样本中能够在表面增强拉曼光谱基底表面上产生表面增强拉曼光谱信号的化学组分数； .2)校正样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应矢量b通过求解如下二次规划问题获得其中…^彳为平衡上式两部分的权重参数，。,!^〃;... ； Ck； ! ； . . . ；CK；1]为内标组分在校正样本中的浓度矢量，Cj=[c1；J；. . . ；Ck；J；. . . ；CK；J]为目标化学组分在校正样本中的浓度矢量，S. t.表示约束条件。
5.根据权利要求I所述的具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用‘双校正’策略消除未知待测样本中表面增强拉曼光谱信号的乘子效应的步骤如下 1)在校正样本集的表面增强拉曼光谱数据Xeal与(Iiag(ID)C1、以及Xeal与diag(b)Cj之间建立双校正模型，即模型I;模型II :diag(b)Cj=a2l+U2 ;其中，diag(b)为一对角矩阵，其对角元素为矢量b的相应元素；Ci1, ^1, a 2, P2为校正模型参数； 2)测得未知待测样本的表面增强拉曼光谱数据Xun，通过模型II和模型I的预测值的比值乘以未知待测样本中内标化学组分的浓度Cmu求出未知待测样本中待测化学组分的a, + XimB全文摘要
本发明公开了一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析方法，其主要内容包括1)通过在SERS基底上标记适量的巯基化合物制备出具有准确定量功能的SERS基底；2)利用定量SERS基底对待测物质进行SERS分析检测，并建立新型SERS光谱定量分析模型，即乘子效应模型；3)采用独特的SERS定量分析新策略，即先将校正样本中SERS光谱信号的乘子效应估计出来，待测样本中SERS光谱信号的乘子效应则通过‘双校正’策略予以消除，从而实现对待测样本中待测物质浓度的准确预测。本发明很好地解决了复杂化学生物体系的SERS光谱准确定量分析问题。
文档编号G01N21/65GK102735677SQ20121024363
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者俞汝勤, 金竞文, 陈增萍 申请人:湖南大学