专利名称：一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法
技术领域：
本发明涉及一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，具体的说是一种采用高效液相色谱的方法进行拆分利伐沙班光学异构体的分离测定方法。
背景技术：
利伐沙班(Rivaroxaban)是一种新的口服抗凝药物，具有高度选择性和竞争性直接抑制呈游离状态的Xa因子的药物，而且还可抑制结合状态的Xa因子以及凝血酶原活性，对血小板聚集没有直接作用。其具有生物利用度高，治疗疾病谱广，量效关系稳定，口服方便，出血风险低的特点。利伐沙班(rivaroxaban, BAY5927939,商品名:Xarelto)化学名为:5-氯-N-{[2-氧代-3-[4- (3-氧吗啉-4-基)苯基]噁唑烷酮_5_基]甲基}噻吩-2-羧酰胺，其化学结构式如下:
利伐沙班光学异构体分为S型和R型，特别是其中S型异构体的半数抑制浓度(IC5tl)比R构型的小，半数抑制浓度IC5tl是指某种药可以抑制一半病原体生长时的浓度，其值越小越好，因此S型异构体的分离与含量的测定对于最终产品的质量控制是非常重要的，Susanne Roehrig等用Chiral AD (250*2mm)涂敷型手性柱在正庚烧-乙醇-三氟醋酸(10:90:0.2，v/v/v)正相条件下，测定了利伐沙班对映体的ee值，但没有报道分离度，没有系统性考察方法。但涂敷型手性柱在使用四氢呋喃、甲基叔丁基醚、氯代试剂等有机溶剂作为流动相时，手性固定相会被部分或全部溶胀或溶解，破坏了空间结构而失去手性识别能力。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述的利伐沙班光学异构体的拆分使用涂敷型手性柱的局限性而提供一种用高效液相色谱法进行利伐沙班光学异构体的分离测定方法，可用于利伐沙班最终产品光学纯度的控制。本发明的技术方案
一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，即通过选用键合型手性色谱柱IC柱，以三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)纤维素为填充剂，所用的流动相为乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水组成的混合体系液或甲醇-水组成的混合体系液，流速为0.7-1.0ml/min,优选为0.7ml/min，测定过程中柱温箱温度为15-35°C，优选为30°C，检测波长为210_260nm，优选为250nm进行高效液相色谱测定，最终完成利伐沙班光学异构体的分离与测定；
上述流动相中乙腈:水的体积比为40-100:60-0 ；
甲醇:水的体积比为80-100:20-0ο上述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，具体包括如下步骤:
(I )、利伐沙班光学异构体的色谱分离
取待测利伐沙班光学异构体样品适量，用乙腈溶解，配成每Iml乙腈含Img待测利伐沙班光学异构体样品乙腈溶液，进样流速为1.0ml/min，选用键合型手性色谱柱CHIRALPAKIC柱，检测波长为210-260nm，最佳检测波长为250nm ;柱温15_35°C，优选为30°C，进样量5-20 μ I，优选为5 μ I，进入色谱仪，流动相采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水组成的混合体系液或甲醇-水组成的混合体系液，设置流动相流速为0.7-1.0ml/min,优选为0.7ml/min,完成待测利伐沙班光学异构体的分离；
(2)、利伐沙班光学异构体的含量的测定
取已知组成含量的利伐沙班消旋体标准样品，分别用乙腈溶解，配制成每Iml约含Img利伐沙班消旋体标准样品，进样流速为1.0ml/min，选用键合型手性柱CHIRALPAK IC柱，检测波长为210-260nm，最佳检测波长为250nm ;柱温15_35°C，优选为30°C，进样量5-20 μ 1，优选为5 μ 1，进入色谱仪，流动相采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水组成的混合体系液或甲醇-水组成的混合体系液，设置流动相流速为0.7-1.0ml/min,优选为0.7ml/min,完成利伐沙班消旋体样品的分离； 采用面积归一法将步骤(I)所得的利伐沙班光学异构体样品的分离图谱与步骤(2)所得的利伐沙班R构型、S构型或R构型和S构型共同组成的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对从而计算出待测的利伐沙班光学异构体中S构型和R构型的利伐沙班的含量。本发明的有益效果
本发明的一种用高效液相色谱法分离测定利伐沙班光学异构体的方法，由于采用键合型手性IC柱拆分利伐沙班异构体，并使用乙腈-水或甲醇-水的混合流动相体系，打破了涂敷型手性柱的溶剂仅能为正己烷、异丙醇、乙醇等使用的局限性，同时适用于利伐沙班药物的扩大生产中的分离测定。本发明使用的高效液相色谱法分离测定利伐沙班光学异构体的方法能够有效分离测定利伐沙班的光学异构体，并且该方法灵敏度高，分离度良好，结果准确。可用于利伐沙班及其制剂生产过程的质量控制。
图la、实施例1中S构型的利伐沙班异构体标准样品的高效液相色，其中乙腈=100% ；
图lb、实施例1中待测的利伐沙班样品中S构型的利伐沙班及其R构型的利伐 沙班分离的高效液相色谱图，其中乙腈=100% ；
图2、实施例2中待测的利伐沙班样品中S构型的利伐沙班及其R构型的利伐 沙班分离的高效液相色谱图，其中乙腈-水=40-60 (V/V)；
图3、实施例3中待测的利伐沙班样品中S构型的利伐沙班及其R构型的利伐 沙班分离的高效液相色谱图，其中乙腈-水=90-10 (V/V)；
图4、实施例1中待测的利伐沙班样品中S构型的利伐沙班及其R构型的利伐 沙班分离的高效液相色谱图，其中甲醇-水=90-10 (V/V)0
具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。本发明测定所用的仪器的型号及生产厂家的信息如下:戴安(DIONEX) Ultimate 3000,含 Ultimate 3000 Pump, Ultimate 3000Autosampler, Ultimate 3000 Column Compartment, Ultimate 3000 Photodiode ArrayDetector, Chromeleon工作站，美国戴安公司；
IC色谱柱:CHIRALPAK IC (4.6πιπιΦ*250αιι 5 μ m)，大赛璐药物手性技术上海有限公司。实施例1
一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，具体包括如下步骤:
(I )、利伐沙班光学异构体的色谱分离
称取IOmg待测的利伐沙班样品(S构型)，用IOml容量瓶定容到刻度，摇匀，作为供试品溶液I，进样流速为1.0ml/min，检测波长为250nm ;选用IC手性色谱柱，柱温为30°C，进样量5 μ 1，流动相为乙腈=100%，设置流动相流速为0.7ml/min,完成待测利伐沙班光学异构体的分离；
(2)、利伐沙班光学异构体的含量的测定
称取约IOmg的利伐沙班消旋体标准样品，用乙腈溶解，用IOml容量瓶定容到刻度，摇匀，作为供试品溶液2 ；
分别取供试品溶液1，供试品溶液2，按步骤(I)所述色谱条件分析，记录色谱图，结果见图1a和图1b ；
图1a为供试品溶液I即S构型的利伐沙班标准样品的高效液相色谱图，图1a中的22.317min的色谱峰为S构型 的利伐沙班的色谱峰；
图1b为供试品溶液2即待测的利伐沙班消旋体样品的色谱图，图1b中22.317min的色谱峰为S构型的利伐沙班的色谱峰，18.407min的色谱峰为利伐沙班的异构体即R构型的色谱峰。采用面积归一法将步骤(I)所得的待测利伐沙班样品(S构型)的色谱图与步骤
(2)所得的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对，从而计算出待测的利伐沙班光学异构体中S构型的利伐沙班的含量为38%，R构型的利伐沙班的含量为62%。另外，从图1b中可以看出，待测的利伐沙班光学异构体样品中S构型的利伐沙班和R构型的利伐沙班分离良好，满足中国药典的要求。实施例2
分别取实施例1所得的供试品溶液2，按色谱条件即检测波长:250nm，柱温:30°C，流速:0.7ml/min ;流动相:乙腈-水=40-60 (V/V)进行色谱分析,记录色谱图，结果见图2 ;
图2中31.562min的色谱峰为S构型的利伐沙班的色谱峰，27.688min的色谱峰为利伐沙班光学异构体中R构型的利伐沙班的色谱峰。采用面积归一法对所得的利伐沙班光学异构体样品(S构型)的色谱图与实施例1步骤(2)所得的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对，从而得出待测的利伐沙班光学异构体中S构型的利伐沙班的含量为38%，R构型的利伐沙班的含量为62%。另外，从图2中可以看出，待测的利伐沙班光学异构体样品中S构型的利伐沙班和R构型的利伐沙班分离良好，满足中国药典的要求。实施例3
分别取实施例1所得的供试品溶液2，按色谱条件即检测波长:250nm，柱温:30°C，流速:0.7ml/min ;流动相:乙腈-水=90-10 (V/V)进行色谱分析,记录色谱图，结果见图3 ;
图3中9.547min的色谱峰为S构型的利伐沙班的色谱峰，8.877min的色谱峰为利伐沙班光学异构体即R构型的利伐沙班的色谱峰。采用面积归一法对所得的利伐沙班光学异构体样品(S构型)的色谱图与实施例1步骤(2)所得的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对，从而得出待测的利伐沙班光学异构体中S构型的利伐沙班的含量为38%，R构型的利伐沙班的含量为62%。另外，从图3中可以看出，待测的利伐沙班光学异构体样品中S构型的利伐沙班和R构型的利伐沙班分离良好，满足中国药典的要求。实施例4
分别取实施例1所得的供试品溶液2，按色谱条件即检测波长:250nm，柱温:30°C，流速:0.7ml/min ;流动相:甲醇-水=90-10 (V/V)进行色谱分析,记录色谱图，结果见图4 ;
图4中24.058min的色谱峰为S构型的利伐沙班的色谱峰，20.793min的色谱峰为利伐沙班异构体即R构型的利伐沙班的色谱峰。采用面积归一法对所得的利伐沙班光学异构体样品(S构型)的色谱图与实施例1步骤(2)所得的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对，从而得出待测的利伐沙班光学异构体中S构型的利伐沙班的含量为38%，R构型的利伐沙班的含量为62%。另外，从图4中可以看出，待测的利伐沙班光学异构体样品中S构型的利伐沙班和R构型的利伐沙班分离良好，满足中国药典的要求。注:图lb，图2，图3，图4为同一样品在不同色谱分离条件下的色谱图，通过实施例I中S构型的利伐沙班标准样品与利伐沙班消旋体(S构型和R构型)样品的色谱图定位得知，后出峰的色谱峰为利伐沙班的色谱峰即S构型。以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于具体包括如下步骤: (I )、利伐沙班光学异构体的色谱分离 取待测利伐沙班光学异构体(S构型)用乙腈溶解，配成每Iml乙腈含Img待测利伐沙班光学异构体样品乙腈溶液，进样流速为1.0ml/min，选用键合型手性柱CHIRALPAK IC柱，检测波长为210-260nm，柱温15_35°C，进样量5_20 μ 1，流动相采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水组成的混合体系液或甲醇-水组成的混合体系液，设置流动相流速为0.7-1.0ml/min,完成待测利伐沙班光学异构体的分离； (2)、利伐沙班光学异构体的含量的测定 取已知组成含量的利伐沙班消旋体标准样品，分别用乙腈溶解，配制成每Iml约含ImgR构型、S构型或R构型和S构型共同组成的利伐沙班消旋体标准样品，进样流速为1.0ml/min,选用键合型手性柱CHIRALPAK IC柱，检测波长为210_260nm，最佳检测波长为250nm ;柱温15_35°C，进样量5_20 μ 1，流动相采用乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水组成的混合体系液或甲醇-水组成的混合体系液，设置流动相流速为0.7-1.0ml/min,完成利伐沙班R构型、S构型或R构型和S构型共同组成的利伐沙班消旋体标准样品的分离； 采用面积归一法将步骤(I)所得的利伐沙班光学异构体样品(S构型)的图谱与步骤(2 )所得的利伐沙班消旋体标准样品的 分离图谱进行比对从而计算出待测的利伐沙班光学异构体中S构型和R构型的利伐沙班的含量。
2.如权利要求1所述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于步骤(I)中和步骤(2)中的检测波长为250nm，柱温为30°C，进样量5 μ 1，流动相采用乙腈、乙腈-水组成的混合体系液或甲醇-水组成的混合体系液，设置流动相流速为0.7ml/min。
3.如权利要求2所述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于步骤(I)中和步骤(2)中采用乙腈-水组成的混合体系液，按体积比计算，即由乙腈:水为40-90:60-10的比例组成的混合体系液。
4.如权利要求3所述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于步骤(I)中和步骤(2)中采用乙腈-水组成的混合体系液，按体积比计算，即由乙腈:水为40:60的比例组成的混合体系液。
5.如权利要求3所述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于步骤(I)中和步骤(2)中采用乙腈-水组成的混合体系液，按体积比计算，即由乙腈:水为90:10的比例组成的混合体系液。
6.如权利要求2所述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于步骤(I)中和步骤(2)中采用甲醇-水组成的混合体系液，按体积比计算，即由甲醇:水为80-100:20-0的比例组成的混合体系液。
7.如权利要求6所述的一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法，其特征在于步骤(I)中和步骤(2)中采用甲醇-水组成的混合体系液，按体积比计算，即由甲醇:水为90:10的比例组成的混合体系液。
全文摘要
本发明公开一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法。即取待测利伐沙班光学异构体样品和已知组成含量的利伐沙班消旋体标准样品适量，分别用乙腈溶解，配成待测利伐沙班光学异构体样品和已知组成含量的利伐沙班消旋体标准样品乙腈溶液，用键合型手性柱CHIRALPAKIC柱、进样，检测波长为210-260nm，柱温15-35℃，进样量5-20μl，控制流动相流速为0.7-1.0ml/min，完成待测利伐沙班光学异构体的分离；采用面积归一法将所得的利伐沙班光学异构体样品的分离图谱与已知组成的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对从而计算出待测的利伐沙班光学异构体中S构型和R构型的利伐沙班的含量。
文档编号G01N30/02GK103217492SQ20131009864
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者闫茜, 潘仙华, 许旭 申请人:上海应用技术学院