一种用于活细胞温度监测的荧光铜纳米簇的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有荧光的铜纳米簇的制备方法以及在活细胞温度监测方面的应用，属于纳米材料领域。将谷胱甘肽(GSH)同时作为还原剂和保护层加入硝酸铜(Cu(NO3)2)水溶液中反应，成功制备了谷胱甘肽功能化的具有荧光性质的铜纳米簇，而该铜纳米簇的荧光强度与环境温度(15-80℃)呈反向相关关系。该铜纳米簇可被活细胞吞噬，进而可通过其荧光强度的变化监测活细胞在15-45℃范围的温度变化。本发明的方法具有简单、灵敏、无毒等优点，而且铜的来源广泛，展现了该荧光铜纳米簇在生物医学监测方面的应用。
【专利说明】—种用于活细胞温度监测的荧光铜纳米簇
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料和检测【技术领域】，具体涉及具有荧光性质的谷胱甘肽功能化的铜纳米簇的制备，并利用制备的铜纳米簇监测活细胞温度的方法。
【背景技术】
[0002]在生物和医疗诊断中的温度测量以及活细胞灵敏温度探针是一项很重要的工作。由于金属纳米簇有很强的荧光特性，可以应用到这一领域。在活细胞中温度控制着生理反应，是最常测定的参数之一^准确测量活体细胞的温度和温度梯度可以促进细胞生物学和生物医学的发展2，而新型的铜纳米簇温度计可以做到。
[0003]由几个到数十个原子组成的金属荧光纳米簇具有传统的金属纳米粒子没有的光学性能3，过去的研究中，已经有金银纳米簇用于生物学中的荧光标记的相关研究4_7，它们有良好的化学稳定性，耐光性，体积小，良好的生物兼容性，但它们价格非常昂贵，不易获得。而铜分布广泛且便宜易得，铜纳米簇还具有独特的荧光特性8;但铜纳米簇的超小的体积却难以控制，而且在空气中很容易被氧化9，因此，铜纳米簇的研究还处于探索阶段。
[0004]一般荧光铜纳米簇主要由铜离子还原成铜原子，再由铜原子聚合成铜纳米簇，该方法复杂费时，而且由于铜纳米簇的聚合量子产率低。用微孔固体作为保护层如高分子聚合物，带孔沸石1(Η11，但过程仍然很复杂，限制了铜纳米簇的应用。目前，还没有对铜纳米簇应用于细胞温度计的相关报道。
[0005]本发明用谷胱甘肽(GSH)作为还原剂在室温环境条件下制备高荧光性能的铜纳米簇，同时作为保护层防止已经形成的纳米簇聚合。该方法制备的铜纳米簇具有很强的荧光性能，GSH - CuNCs的量子产率达到5.0%，明显高于前人的工作12。鉴于该谷胱甘肽功能化的铜纳米簇方便的制备方法和优良的荧光特性，以及良好的生物兼容性以及对温度的灵敏响应，该方法制备的铜纳米簇可以用作荧光纳米温度计或生物传感器。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种利用具有强荧光性质的铜纳米簇监测活细胞温度的方法。
[0007]谷胱甘肽(GSH)含有-NH2, -C00H, -SH这些的官能团，可以兼做还原剂和保护层将硝酸铜(Cu(NO3)2)还原，生成谷胱甘肽功能化的荧光铜纳米簇(GSH-CuNCs)，在波长为410nm处激发，在610nm处得到最大发射峰(图1);在自然光下呈现淡蓝色,而在紫外光照射下显示明亮的红光，特征吸收峰在300nm以下(图2)，说明铜纳米簇制备成功13_14。透射电镜图(图3)，结果显示铜纳米簇均匀分布，直径介于1.5-3.0，平均直径为2.3nm，没有大的纳米粒子或铜纳米簇的团聚，该铜纳米簇在水溶液中具有良好的分散性。
[0008]该方法制备的铜纳米簇水溶性良好，很强的红色荧光，较高的量子产率。铜纳米簇的荧光信号与环境温度的变化成反比关系，重现性很好。噻唑蓝比色法显示，该方法制备的铜纳米簇可以进入细胞质甚至细胞核，显现很好的生物兼容性，借助激光扫描共聚焦荧光显微镜，显示这种铜纳米簇能监测MC3T3-E1癌细胞内的温度变化(15-45°C )。鉴于该方法制备铜纳米簇的条件温和并且有很强的荧光特性，使其在活细胞传感方面有好的应用前旦
-5^ O
[0009]一种荧光铜纳米簇用于监测活细胞温度的方法具体涉及谷胱甘肽功能化的铜纳米簇的制备及其在监测活细胞温度方面的应用，具体过程如下:
[0010]1、谷胱甘肽功能化的铜纳米簇的制备:
[0011]将GSH 31mg和Cu(N03)26mg即4:1的摩尔比加入到5mL去离子水中，在室温下(250C )搅拌1min至形成白色的水凝胶，水凝胶再在80°C下搅拌30min，然后一滴滴加入lmol/L NaOH溶液直至得到淡黄色透明溶液。待冷却到室温后，加入乙醇在6000rpm转速下离心分离3次，取底部的沉淀物冷冻干燥得到GSH-CuNCs，可以长期储存在冰箱使用。
[0012]2、谷胱甘肽功能化的铜纳米簇水溶液用于活细胞温度的监测:
[0013]噻唑蓝染色实验显示铜纳米簇可以进入活细胞，甚至细胞核。将MC3T3-E1细胞置于80 μ g/mL谷胱甘肽功能化的铜纳米簇水溶液中培养48h后，仍然存活80%以上，结果显示该铜纳米簇有很好的细胞相容性而且对该活细胞没有副作用。共聚焦荧光显微镜显示，该铜纳米簇不仅进入细胞质中，而且有进入细胞核。将培养后的活细胞分成三个部分，分别置于不同的环境温度下并测定相应的荧光强度，结果显示当温度上升的情况下，荧光强度相应降低，使得该铜纳米簇用于活细胞温度的监测成为可能。
[0014]本发明具有如下优点:
[0015]1.铜原材料的来源广泛，廉价易得。
[0016]2.制备条件温和、方便、容易操作。
[0017]3.对生理活细胞无任何毒副作用，具备良好的生物兼容性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1荧光铜纳米簇的荧光光谱图；
[0019]图2荧光铜纳米簇的紫外可见光谱图；
[0020]图3荧光铜纳米簇的透射电镜图；
[0021 ] 图4荧光铜纳米簇荧光强度与环境温度变化关系图及重现性；
[0022]图5荧光铜纳米簇在活细胞中荧光强度与温度变化关系图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图对本发明进一步说明。
[0024]利用谷胱甘肽功能化的铜纳米簇监测环境的温度
[0025]1、谷胱甘肽功能化的铜纳米簇的制备:
[0026]将GSH 31mg和Cu(N03)26mg即4:1的摩尔比加入到5mL去离子水中，在室温下(250C )搅拌1min至形成白色的水凝胶，水凝胶再在60°C下搅拌30min，然后一滴滴加入lmol/L NaOH溶液直至得到淡黄色透明溶液。待冷却到室温后，加入乙醇在6000rpm转速下离心分离3次，取底部的沉淀物冷冻干燥得到GSH-CuNCs，可以长期储存在冰箱使用。
[0027]2、谷胱甘肽功能化的铜纳米簇水溶液用于环境温度的监测:
[0028]铜纳米簇的荧光强度与环境温度的变化成反比关系，而且重现性很好。结果如图
4。
[0029]3、利用谷胱甘肽功能化的铜纳米簇监测人体癌细胞MC3T3-E1在不同环境温度下的温度
[0030]噻唑蓝染色实验显示铜纳米簇可以进入活细胞，甚至细胞核。将MC3T3-E1细胞置于80 μ g/mL谷胱甘肽功能化的铜纳米簇水溶液中培养48h后，仍然存活80%以上，结果显示该铜纳米簇有很好的细胞相容性而且对该活细胞没有副作用。共聚焦荧光显微镜显示，该铜纳米簇不仅进入细胞质中，而且有进入细胞核。将培养后的活细胞分成三个部分，分别置于不同的环境温度下并测定相应的荧光强度，结果显示当温度上升的情况下，荧光强度相应降低，结果如图5，使得该铜纳米簇用于活细胞温度的监测成为可能。
[0031]参考文献
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【权利要求】
1.将谷胱甘肽功能化的铜纳米簇应用于活细胞温度的监测。
2.权利要求1所述的谷胱甘肽功能化的铜纳米簇具有的特征是:铜纳米簇含有1-3个原子，粒径为1.5-3nm,激发波长为410nm,发射波长为610nm。
3.权利要求1所述的活细胞温度监测，是指活细胞吞噬了铜纳米簇后，其荧光强度会随着环境温度的升高而降低，因此可利用共聚焦荧光成像的方法测量活细胞在15-45°C的生理范围的温度值。
4.权利要求1所述的活细胞温度监测中的细胞可以是人体癌细胞MC3T3-E1。
【文档编号】G01K11/00GK104458050SQ201410707337
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】许春华, 王婵, 宋启军 申请人:江南大学