一种结石通片指纹图谱的建立方法与流程

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种结石通片指纹图谱的建立方法。

背景技术：
中药复方控制是制约中药现代化发展的关键问题之一。中医理论强调中药的整体效应，重视在药效上的协同作用，以中药内一、二个有效成分作为定性、定量指标远不能有效地控制和评价中药的质量，更难以反映其安全性和有效性。中药复方是两味以上中药组合应用于疾病治疗的复方制剂，其质量控制的难度较单味中药更甚。近年来，中药指纹图谱和特征指纹图谱已广泛应用于质量控制，其中中药特征图谱系指从中药指纹图谱中选取若干专属性强的色谱峰或色谱峰组合特征指纹图谱，通过特征指纹峰的有无及变化来监控中药质量。结石通片由广金钱草、石韦、车前草、茯苓等多味药材组成，具有清热利尿、通淋排石、镇痛止血之功效。临床多用于治疗泌尿系统感染，膀胱炎，肾炎水肿，尿路结石，血尿，淋沥混浊，尿道灼痛等，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十三册。目前结石通片的质量控制方法主要依据标准WS3-B-2589-97质量标准中仅有性状和检查项，难以控制药品的质量。

技术实现要素：
本发明针对现行结石通片质量标准相对落后，仅有性状、检查项目，不能有效的控制成药质量的问题，提供一种结石通片指纹图谱的建立方法，通过结石通片指纹图谱方法的建立，以及由此方法得到的结石通片的标准指纹图谱，有效地控制结石通片的质量，弥补现有质量控制技术的不足，从而确保结石通片的有效性、安全性和稳定性。本发明通过以下技术方案实现上述目的：一种结石通片指纹图谱的建立方法，该方法包括采用高效液相色谱法对结石通片进行检测，其中色谱条件包括；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，流动相C为甲醇；采用梯度洗脱，洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比体积：0～10min，流动相A为10％，流动相B为85％；流动相C为5％；10～20min，流动相A为10％；流动相B为85％→82％；流动相C为5％→8％；20～30min，流动相A为10％→12％；流动相B为82％→80％；流动相C为8％；30～60min，流动相A为12％→17％；流动相B为80％→75％；流动相C为8％；检测波长为272；理论塔板数按夏佛塔苷计算不低于3000。所述结石通片指纹图谱的建立方法，还包括通过以下步骤制备对照品溶液：取夏佛塔苷对照品，精密称定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得。所述结石通片指纹图谱的建立方法，还包括通过以下步骤制备供试品溶液：结石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，补重，滤过，滤液用30ml石油醚萃取2次，弃去石油醚，用乙酸乙酯摇提2次，每次15ml，合并滤液，水浴蒸干，残渣加10ml60％甲醇溶液溶解，过滤，补足重量，0.45um微孔滤膜过滤，即得。优选地，所述结石通片指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：取夏佛塔苷对照品，精密称定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得；(2)制备供试品溶液：结石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，补重，滤过，滤液用30ml石油醚萃取2次，弃去石油醚，用乙酸乙酯摇提2次，每次15ml，合并滤液，水浴蒸干，残渣加10ml60％甲醇溶液溶解，过滤，补足重量，0.45um微孔滤膜过滤，即得；(3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul注入高效液相色谱仪，根据以下条件进行测定，记录色谱图，得到结石通片指纹图谱；其中，色谱条件包括：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，流动相C为甲醇；采用梯度洗脱，洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比体积：0～10min，流动相A为10％，流动相B为85％；流动相C为5％；10～20min，流动相A为10％；流动相B为85％→82％；流动相C为5％→8％；20～30min，流动相A为10％→12％；流动相B为82％→80％；流动相C为8％；30～60min，流动相A为12％→17％；流动相B为80％→75％；流动相C为8％；检测波长为272；理论塔板数按夏佛塔苷计算不低于3000。所述结石通片指纹图谱的建立方法，还包括：对多个结石通片指纹图谱进行比较，选出共有特征峰，得到结石通片特征指纹图谱。所述结石通片指纹图谱的建立方法，在于结石通片指纹图谱或结石通片特征指纹图谱中包含20个特征峰，各特征峰保留时间为：峰1:10.72min、峰2:11.35min、峰3:14.44min、峰4:15.36min、峰5:19.58min、峰6:20.56min、峰7:21.18min、峰8:22.43min、峰9:25.68min、峰10:26.57min、峰11:27.22min、峰12：29.35min、峰13:30.44min、峰14:31.36min、峰15:34.58min、峰16:35.56min、峰17:39.18min、峰18:43.43min、峰19:45.68min、峰20:50.57min。所述结石通片指纹图谱的建立方法，在于结石通片指纹图谱或结石通片特征指纹图谱中，以夏佛塔苷为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：峰1：0.5438、峰2:0.5642、峰3:0.7514、峰4：0.7907、峰5:1、峰6:1.0686、峰7:1.0891、峰8:1.1732、峰9:1.3583、峰10:1.3812、峰11:1.4547、峰12:1.5358、峰13:1.5742、峰14：1.6397、峰15:1.7273、峰16:1.7909、峰17:1.9850、峰18:2.1555、峰19:2.2651、峰20:2.5118所述结石通片指纹图谱或结石通片特征指纹图谱中，5号锋为夏佛塔苷对照峰。色谱条件的对比(1)色谱柱：比较C18柱、苯基柱、氨基柱等常用色谱柱，发现C8柱与苯基柱对结石通片中成分保留极差，不能全面反映结石通片成分。氨基柱为正向分配体系，不适合本次实验。选择C18柱进行分离，得到了较好的效果。(2)流动相：通过研究发现，单纯使用乙腈-磷酸水体系或者甲醇-磷酸水体系，其样品溶液不出峰或出峰很少，上述体系的分离效果差，无法将药品中的成分尽可能的分离，从而很难依据其图谱进行鉴别，同时由于结石通里面成分极性相差较大，使用单一体系比不能照顾全部的成分，单纯使用水来做无机相，分离效果差，峰形难看，保留时间波动较大，根本不能满足特征图谱的建立要求。结合现有技术的流动相及其分离的结石通片中未知成分的峰的特点，通过创造性劳动，最终确定使用乙腈-磷酸水-甲醇的三元体系，此条件下，各色谱峰峰形尖锐，分离度较好，保留时间适中。(3)检测波长：通过DAD色谱扫描技术，本发明选取了272nm作为检测波长，在此波长下，色谱法较多，基线平稳，各峰分离度较好。本发明还提供一种结石通片的鉴定方法，该方法包括将根据上述方法建立待测样品指纹图谱或特征指纹图谱与根据上述方法建立的标准指纹图谱或特征指纹图进行比较，以鉴别真伪。结石通片质量控制：利用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件，将结石通片指纹图谱与标准指纹图谱进行比较，结石通片指纹图谱以20个特征峰计算相似度不低于0.8的结石通片为质量合格，本发明将结石通片作为一个整体对待，通过比较其特征峰可以找出不同批次之间的细微差异，适于对结石通片品质的鉴别和控制。本发明的优点是：1、现行《卫生部药品标准中药成方制剂》中，结石通片质量标准仅有性状、检查项目，不能有效的控制结石通片质量。指纹图谱技术是中药现代化的关键技术之一，是中药质量控制的最先进技术，我们运用指纹图谱技术有效的控制结石通片的质量，弥补了现有质量控制技术的不足，只要供选择的制剂中出现本申请所指定的指纹图谱，即可确认为结石通片，从而确保结石通片的有效性，安全性。2、采用高效液相色谱法确定结石通片指纹图谱的过程中，通过流动相、分离条件及参数的选择，最终选用乙腈有机相，可减少由于梯度变化引起的梯度峰，选择体积分数比为0.2的磷酸为流动相B进行调节峰前沿，通过具体时间程序改变流动相比例，以上过程的具体参数相互配合，使目标峰均能与杂质峰有很好的分离，同时能很好的相应及相对稳定的保留时间，从而得到一个良好的特征图谱。3、本发明采用结石通片指纹图谱作为结石通片制剂的质量控制手段，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，本发明为完整、准确评价结石通片的质量提供了有效方法，从而使产品的质量和疗效得到保证。4、本发明具有简便，易于掌握，稳定，精密度高，重现性好的特点。附图说明图1为实施例1中所述结石通片20个特征峰的指纹图谱。图2为实施例2中结石通片十批样品指纹图谱。具体实施方式实施例1：结石通片HPLC特征图谱建立实验1.仪器、试药和供试样品仪器：高效液相色谱仪：waterse2695泵，UV2998检测器电子天平：CP214奥豪斯仪器对照品：夏佛塔苷(四川省维克奇生物科技有限公司制，HPLC大于98)，批号：121015样品：结石通片(广西梧州制药(集团)股份有限公司提供)，批号分别为：140603、140204、140605、140703、140704、140705、140706、140707、140802、140803、1408052.色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A；以0.2％磷酸水溶液为流动相B；以甲醇为流动相C，温度为室温，流速为1.0ml/min，按以下程序进行梯度洗脱；检测波长为272nm；理论塔板数按夏佛塔苷计应不低于3000；0～10min，流动相A为10％，流动相B为85％；流动相C为5％；10～20min，流动相A为10％；流动相B为85％→82％；流动相C为5％→8％；20～30min，流动相A为10％→12％；流动相B为82％→80％；流动相C为8％；30～60min，流动相A为12％→17％；流动相B为80％→75％；流动相C为8％。即，0分钟至10分钟内，流动相A体积比例为10％，流动相B体积比例为85％；流动相C体积比例为5％；10分钟至20分钟内，流动相A体积比例为10％；流动相B体积比例由85％渐变至体积比例82％；流动相C体积比例由5％渐变至体积比例8％；20分钟至30分钟内，流动相A体积比例由10％渐变至体积比例12％；流动相B体积比例由82％渐变至体积比例80％；流动相C体积比例为8％；30分钟至60分钟内，流动相A体积比例由12％渐变至体积比例17％；流动相B体积比例由80％渐变至体积比例75％；流动相C体积比例为8％。3.对照品溶液的制备取夏佛塔苷对照品，精密称定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得。4.供试品溶液的制备:结石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，补重，滤过，滤液用30ml石油醚萃取2次，弃去石油醚，用乙酸乙酯摇提2次，每次15ml，合并滤液，水浴蒸干，残渣加10ml60％甲醇溶液溶解，过滤，补足重量，0.45um微孔滤膜过滤，即得。5.结石通片标准指纹图谱的制定取结石通片10批，按照供试品溶液的制备方法制备供试品，在上述液相色谱条件下，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。依据10批样品的指纹图谱，制定特征图谱。供试品特征图中应呈现20个特征峰，其中1个峰应与相应的对照品峰保留时间相一致；以夏佛塔苷参照峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，结果表明，各共有特征峰的相对保留时间的RSD均小于2％，符合指纹图谱分析要求。根据标准指纹图谱，相对保留时间规定值为峰1：0.5438、峰2:0.5642、峰3:0.7514、峰4：0.7907、峰5:1、峰6:1.0686、峰7:1.0891、峰8:1.1732、峰9:1.3583、峰10:1.3812、峰11:1.4547、峰12:1.5358、峰13:1.5742、峰14：1.6397、峰15:1.7273、峰16:1.7909、峰17:1.9850、峰18:2.1555、峰19:2.2651、峰20:2.5118。在20个特征峰中，5号峰与夏佛塔苷对应的峰，其保留时间一致。表1共有特征峰相对保留时间表峰号相对保留时间10.543820.564230.751440.79075161.068671.089181.173291.3583101.3812111.4547121.5328131.5742141.6397151.7273161.7909171.985182.1555192.2651202.5118实施例2：结石通片HPLC特征图谱建立结石通片由广西梧州制药(集团)股份有限公司提供。照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VID)测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A；以0.2％磷酸水溶液为流动相B；以甲醇为流动相C，温度为室温，流速为1.0ml/min，按以下程序进行梯度洗脱；检测波长为272nm；理论塔板数按夏佛塔苷计应不低于3000；0～10min，流动相A为10％，流动相B为85％；流动相C为5％；10～20min，流动相A为10％；流动相B为85％→82％；流动相C为5％→8％；20～30min，流动相A为10％→12％；流动相B为82％→80％；流动相C为8％；30～60min，流动相A为12％→17％；流动相B为80％→75％；流动相C为8％；即，0分钟至10分钟内，流动相A体积比例为10％，流动相B体积比例为85％；流动相C体积比例为5％；10分钟至20分钟内，流动相A体积比例为10％；流动相B体积比例由85％渐变至体积比例82％；流动相C体积比例由5％渐变至体积比例8％；20分钟至30分钟内，流动相A体积比例由10％渐变至体积比例12％；流动相B体积比例由82％渐变至体积比例80％；流动相C体积比例为8％；30分钟至60分钟内，流动相A体积比例由12％渐变至体积比例17％；流动相B体积比例由80％渐变至体积比例75％；流动相C体积比例为8％。对照品溶液的制备：取夏佛塔苷对照品，精密称定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得。供试品溶液的制备：结石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，补重，滤过，滤液用30ml石油醚萃取2次，弃去石油醚，用乙酸乙酯摇提2次，每次15ml，合并滤液，水浴蒸干，残渣加10ml60％甲醇溶液溶解，过滤，补足重量，0.45um微孔滤膜过滤，即得。测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品特征图中应呈现20个特征峰，其中1个峰应与相应的对照品峰保留时间相一致；以夏佛塔苷参照峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，结果表明，各共有特征峰的相对保留时间的RSD均小于2％，符合指纹图谱分析要求。根据标准指纹图谱，相对保留时间规定值为峰1：0.5438、峰2:0.5642、峰3:0.7514、峰4：0.7907、峰5:1、峰6:1.0686、峰7:1.0891、峰8:1.1732、峰9:1.3583、峰10:1.3812、峰11:1.4547、峰12:1.5358、峰13:1.5742、峰14：1.6397、峰15:1.7273、峰16:1.7909、峰17:1.9850、峰18:2.1555、峰19:2.2651、峰20:2.5118。在20个特征峰中，5号峰与夏佛塔苷对应的峰，其保留时间一致。