葡萄酒中酰胺类杀菌剂的固相萃取‑液相色谱‑串联质谱检测方法与流程

本发明属于食品检测领域，涉及固相萃取-液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，具体是指一种葡萄酒中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的检测方法，尤其适用于葡萄酒。

背景技术：

随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，葡萄酒这一集营养性、功能性以及文化品位于一体的特殊饮品越来越受到人们的喜爱。浙江作为我国东南沿海经济较发达的省份，近年来葡萄酒消费量增长迅速，特别是进口葡萄酒。浙江口岸进口葡萄酒贸易额一直居全国同行业领先地位。2015年，浙江口岸共进口葡萄酒3.11万吨，比上年增长10.2%，货值1.2亿美元，市场交易额35亿元，进口量排名仅次于上海、深圳、广州、天津等口岸。葡萄酒消费市场的火爆程度可见一斑。

然而，不论是进口还是国产葡萄酒，葡萄作为其最主要的生产原料在田间管理过程中，为防止病害发生，通常会喷施一定量的农药，有些农药在葡萄酒生产发酵过程中不易去除分解，会不同程度地残留在葡萄酒中，给饮用者健康带来潜在的威胁。2013年，美国环境工作组(EWG)发布的 “最肮脏果蔬”黑名单中，葡萄位列第三，共检出15种农药残余成分，而在含有的农药种类方面，葡萄则位居榜首，总共含有64种不同的化学物质。因此，葡萄酒中的农药残留问题不容小觑。

目前，有些国家已经对酰胺类农药在食品中的最大残留量做了严格规定，如欧盟法规规定：在葡萄中双炔酰菌胺(Mandipropamid)的最大残留量为2.0 mg/kg，氟啶酰菌胺(Fluopicolide)的最大残留量为2.0 mg/kg，硅噻菌胺(Silthiofam)的最大残留量更是低至0.01 mg/kg。这些法规在保护消费者健康利益的同时，也是重要的技术性贸易壁垒措施。

因此，建立准确、可靠地测定葡萄酒中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的含量非常重要。

目前，常规的分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定量分析一般采用色谱技术和色谱质谱联用技术，色谱技术有气相色谱和液相色谱等方法，色谱质谱联用技术有液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定，对禁用药物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且要达到该法案规定的4个确证点。

目前，由于国内外无相关标准或文献可循，因此，有必要对葡萄酒中的双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的检测方法进行研究，从而对葡萄酒中酰胺类杀菌剂进行监测，同时为国内葡萄酒企业出口到欧盟等地区时，能出具符合欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定的检测数据。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种葡萄酒中酰胺类杀菌剂的液相色谱-串联质谱检测方法，该方法结合固相萃取-液相色谱-串联质谱法，能够对葡萄酒中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂同时进行测定，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为葡萄酒的快速检测提供了可靠的检测方法支持。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种葡萄酒中酰胺类杀菌剂的固相萃取-液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取4.7-5.3g葡萄酒样本，葡萄酒样本中加入超纯水，混匀后得到待检液；

（二）待检液的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤（一）制备的待检液上固定相萃取柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；

（三）标准溶液的配置：分别配制双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺溶液阶梯浓度的混合标准工作溶液1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL，内标物噻唑菌胺-D5浓度为10.0 ng/mL，

（四）待测样品溶液的检测：将步骤（二）中的待测样品溶液和混合标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5的浓度为横坐标，再以混合标准工作溶液中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算，内标法定量(内标物为噻唑菌胺-D5)，获得待测样品溶液中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺的浓度。

进一步的，所述步骤（二）中的固定相萃取柱为Waters Oasis HLB SPE柱，并通过甲醇、水对SPE柱进行活化处理。

进一步的，所述步骤（二）中的淋洗溶剂为水和体积比为1/3的甲醇水混合溶液，洗脱溶剂为甲醇。

进一步的，所述的步骤（三）中液相色谱-串联质谱仪的检测参数为：

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈反相柱；

流速：0.25 mL/min；

流动相：A为0.15%甲酸水溶液；B为乙腈；

进样量：5μL；

色谱柱温度：30 ºC；

电喷雾离子源：正离子扫描，电压为5000V；

离子源温度：450 ºC；

雾化气压力：50 psi；

辅助气流速：40 psi ；

气帘气压力：20 psi ；

碰撞气压力：20 psi。

采用上述方案，本发明通过加入超纯水对葡萄酒样品进行稀释，并对由超纯水稀释得到的待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和富集的过程。第一步纯化：先将待检液通过固相萃取小柱，依次经过经水和甲醇/水溶液淋洗、甲醇洗脱；第二步富集：将第一步中纯化的待检液氮气浓缩近干，然后加入甲醇溶液溶解、经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为Waters Oasis HLB SPE柱，由于4种酰胺类杀菌剂和其他杂质的极性大小存在差异，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的淋洗条件和洗脱条件，达到净化富集杀菌剂的目的。

其次，本发明对于葡萄酒中的双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂成分的定性定量检测分析是通过液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)分析。先配置一组阶梯形的标准工作溶液，然后将标准工作液和待检液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5 %，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有酰胺类杀菌剂。

最后，本方法采用同位素内标法进行定量，对定量结果更加准确。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

附图说明

附图1为本发明具体实施例中的噻唑菌胺化学结构式；

附图2为本发明具体实施例中的双炔酰菌胺化学结构式；

附图3为本发明具体实施例中的氟啶酰菌胺化学结构式；

附图4为本发明具体实施例中的硅噻菌胺化学结构式；

附图5为本发明具体实施例中的噻唑菌胺-D5化学结构式；

附图6为本发明具体实施例中噻唑菌胺杀菌剂标准溶液(1.0 ng/mL) MRM色谱图；

附图7为本发明具体实施例中双炔酰菌胺杀菌剂标准溶液(1.0 ng/mL) MRM色谱图；

附图8为本发明具体实施例中氟啶酰菌胺杀菌剂标准溶液(1.0 ng/mL) MRM色谱图；

附图9为本发明具体实施例中硅噻菌胺杀菌剂标准溶液(1.0 ng/mL) MRM色谱图；

附图10为本发明具体实施例中噻唑菌胺-D5杀菌剂标准溶液(1.0 ng/mL) MRM色谱图

附图11为本发明具体实施例中噻唑菌胺杀菌剂扫描二级质谱图；

附图12为本发明具体实施例中双炔酰菌胺杀菌剂扫描二级质谱图；

附图13为本发明具体实施例中氟啶酰菌胺杀菌剂扫描二级质谱图；

附图14为本发明具体实施例中硅噻菌胺杀菌剂扫描二级质谱图；

附图15为本发明具体实施例中噻唑菌胺-D5杀菌剂扫描二级质谱图；

附图16为本发明具体实施例中噻唑菌胺标准工作曲线；

附图17为本发明具体实施例中双炔酰菌胺标准工作曲线；

附图18为本发明具体实施例中氟啶酰菌胺标准工作曲线；

附图19为本发明具体实施例中硅噻菌胺标准工作曲线。

具体实施方式

本发明的具体实施例如图1-19所示是葡萄酒中酰胺类杀菌剂的液相色谱-串联质谱检测方法，其包括以下步骤：

待测样品的制备：称取葡萄酒样品5.0g，加入3 mL超纯水混匀得到待检液；

固相萃取净化：取HLB SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取全部待检液至SPE柱，再依次用4～6mL水和4～6mL甲醇/水混合溶液(v/v, 1/3)淋洗SPE柱，将SPE柱真空抽干，用6～8mL的甲醇对SPE柱进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液浓缩后，用2 mL甲醇稀释过微孔滤膜后得到待测样品溶液；

标准溶液的配置：取双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5标准品，用甲醇分别配制成质量浓度为400 mg/L的单标储备液，进行测定使用时，用甲醇稀释上述标准储备液，将双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺分别配制成1.0ng/mL，2.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL的混合标准工作溶液，内标物噻唑菌胺-D5浓度为10.0 ng/mL；

待测样品的检测：将步骤（二）（三）中的待测样品溶液和标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以标准溶液中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的浓度为横坐标，再以标准溶液中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的的峰面积为纵坐标的工作曲线，结果表明，4种酰胺类杀菌剂在1.0-20.0 ng/mL范围内具有良好的线性关系，R²≥0.99，以10倍信噪比(S/N)为方法定量限即LOQ，经样品添加试验确定4种酰胺类杀菌剂的定量限均为0.5 ng/g。还有获得可以确定母离子的双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算，内标法定量(内标物为噻唑菌胺-D5)，获得待测样品溶液中双炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4种酰胺类杀菌剂的浓度。

表1 - 4种酰胺类杀菌剂LC-MS/MS检测条件

^*MS/MS定量离子对

表2 - 4种酰胺类杀菌剂的线性方程、相关系数、定量限

表 -4种酰胺类杀菌剂添加回收率、精密度 (n=6)

本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。