本发明属于检测分析领域，具体涉及一种含二硫代氨基甲酸酯类化合物的样品的前处理方法，还涉及检测样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的方法、试剂盒及用途。
背景技术：
二硫代氨基甲酸酯类化合物是一类有机硫农药的总称，分为福美类和代森类，因其广谱、高效的杀菌作用，被广泛用于烟草、粮食、蔬菜、果木、棉花等的病害防治中。但随着二硫代氨基甲酸酯类化合物的广泛应用，人们发现在施用过它的作物、食品及动植物的代谢过程中产生一种叫乙撑硫脲(ETU)的代谢物质，其化学名称为四氢咪唑-2-硫酮。据报道，ETU具有致癌性、致畸性和致突变性，能长期影响甲状腺功能，被美国职业安全和健康署(OSrtA)作为致癌物编入册子。此外，二硫代氨基甲酸酯类化合物对哺乳动物皮肤和呼吸器官有中度刺激，表现为发痒、咽喉痛、气管发炎等症状。许多国家和国际组织对二硫代氨基甲酸酯类农药在各类农产品中的最高残留量进行限定，如欧盟规定其在豆类中的最高残留限量为lmg/kg(以二硫化碳计)，在芒果中的最高残留限量为2mg/kg(以二硫化碳计)。
现有的检测分析二硫代氨基甲酸酯类农药残留的方法，包括分光光度法、气相色谱法和液相色谱法等。这些方法均采用酸性氯化亚锡溶液在超声加热条件下将二硫代氨基甲酸酯类农药残留还原为二硫化碳，并利用异辛烷萃取二硫化碳，最后分离出含有二硫化碳的异辛烷层进行检测。这种方法存在以下问题：
第一，超声加热的反应条件较为剧烈，反应产生的部分二硫化碳以气态形式蒸发，无法被异辛烷萃取，导致检测结果偏低；
第二，二硫化碳在水和异辛烷两相中以一定比例分配溶解，并未完全溶解于异辛烷中，导致检测结果偏低，同时溶解比例的分配受温度等因素的影响，使得检测结果的稳定性差；
第三，操作步骤繁琐，影响因素多，对操作人员的要求较高；
第四，高温条件下异辛烷的挥发对环境和操作人员的健康存在风险。
目前尚需一种准确性高、稳定性好、简便和环保的检测二硫代氨基甲酸酯类农残的方法。
技术实现要素：
本发明人创造性地发现了一种含二硫代氨基甲酸酯类化合物的样品的前处理方法，通过将样品与酸性氯化亚锡乙醇溶液混合，分离即得到含二硫化碳的溶液，操作简便，二硫化碳的提取率高，所得溶液杂质含量低。本发明人还得到一种检测样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的方法，该方法的准确性高、稳定性好、简便、环保。并且，本发明人还获得了一种用于检测样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的试剂盒。
本发明第一方面涉及一种含二硫代氨基甲酸酯类化合物的样品的前处理方法，包括如下步骤：
将所述样品与酸性氯化亚锡乙醇溶液混合，分离得到含二硫化碳的溶液；
可选地，还包括在混合之后和分离之前，进行静置的步骤。
不拘于理论的限制，样品中的二硫代氨基甲酸酯类化合物与氯化亚锡在酸性条件下反应，生成二硫化碳；生成的二硫化碳溶解于氯化亚锡乙醇溶液的乙醇中，静置，分离得到含二硫化碳的溶液。
本发明第一方面的一个实施方式中，在分离和/或静置的过程中，体系的温度保持在35℃～44℃，优选为38.5℃～41.5℃，更优选为38.5℃、40℃或41.5℃。
在一个实施方案中，在整个前处理过程中，体系的温度保持在35℃～44℃，优选为38.5℃～41.5℃，更优选为38.5℃、40℃或41.5℃。
在一个实施方案中，所述酸性氯化亚锡乙醇溶液的配制方法为：将氯化亚锡溶解于乙醇或无水乙醇中，滴入酸溶液调节pH值至酸性；优选地，所述酸溶液选自盐酸溶液、硫酸溶液和硝酸溶液中的一种或多种。
本发明第一方面的一个实施方式中，包括如下1)至11)中的任意一项或者多项：
1)所述样品为固态样品；优选地，所述样品取自食品(例如农副产品)，更优选取自水果(例如苹果)、烟草、烟草制品或茶叶；
2)还包括，在混合之前，将样品进行干燥的步骤，优选在40℃下烘干24小时；
3)所述样品的含水量≤1％(W/W)；
4)所述酸性氯化亚锡乙醇溶液的含水量≤1％(W/W)；
5)相对于每克所述样品，所述酸性氯化亚锡乙醇溶液的用量为10～60mL，优选为20～50mL，更优选为20mL、25mL、30mL、40mL或50mL；
6)所述酸性氯化亚锡乙醇溶液的pH值≤6.8，优选为≤6.2、2～6.5、4～6.5或4～6，更优选为4、5.5或6；
7)所述酸性氯化亚锡乙醇溶液中氯化亚锡的浓度为0.2～2mol/L，优选为0.2～1.5mol/L，0.3～1.4mol/L、0.4～1.2mol/L或0.5～1mol/L，更优选为0.5mol/L、0.75mol/L或1mol/L；
8)所述酸性氯化亚锡乙醇溶液中形成酸性的物质选自盐酸溶液、硫酸溶液和硝酸溶液中的一种或多种；
9)所述混合在磁力搅拌条件下进行；优选地，搅拌速率为50～100转/分钟，更优选为60～90转/分钟，进一步优选为60转/分钟、75转/分钟或90转/分钟；优选地，搅拌时间为0.2～2小时，更优选为0.5～1小时，进一步优选为0.5小时、0.75小时或1小时；
10)所述混合不在超声条件下进行；
11)静置时间为5～25分钟，优选为10～20分钟、10分钟、15分钟或20分钟。
本发明第一方面的一个实施方式中，所述前处理在密闭容器中进行。
本发明第二方面涉及一种检测样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的方法，包括按照本发明第一方面任一项所述的前处理方法得到含二硫化碳的溶液的步骤；以及测定所述溶液中的二硫化碳的步骤。
本发明第二方面的一个实施方式中，所述测定在35℃～44℃下进行，优选地，在38.5℃～41.5℃下进行，更优选地，在38.5℃、40℃或41.5℃下进行。
本发明第二方面的一个实施方式中，所述测定为定量测定。
本发明第二方面的一个实施方式中，还包括下述步骤：根据所述溶液中二硫化碳的定量测定结果，计算出样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量；
优选地，样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量以二硫化碳的含量计。
本发明第二方面的一个实施方式中，所述定量测定包括测定二硫化碳与显色剂反应生成的显色物质的含量的步骤。
在一个实施方案中，所述显色物质为二乙氨基二硫代甲酸铜。
在一个实施方案中，所述显色剂为铜盐—二乙胺乙醇溶液。
本发明第二方面的一个实施方式中，包括如下A至E中的任意一项或者多项：
A.所述铜盐为乙酸铜；
B.所述铜盐—二乙胺乙醇溶液中铜盐的浓度为0.02～1mol/L，优选为0.04～0.8mol/L，更优选为0.05mol/L、0.1mol/L或0.75mol/L；
C.所述铜盐—二乙胺乙醇溶液中二乙胺的浓度为0.005～0.4mol/L，优选为0.01～0.3mol/L，更优选为0.01mol/L、0.04mol/L或0.25mol/L；
D.所述铜盐—二乙胺乙醇溶液的含水量≤1％(W/W)；
E.所述定量测定采用分光光度法进行。
不拘于理论的限制，本发明中显色反应的机理：在铜盐(乙酸铜)存在下，二硫化碳与二乙胺作用，生成黄棕色的二乙氨基二硫代甲酸铜，根据分光光度的检测结果计算其含量范围，进而计算出样品中二硫代氨基甲酸酯含量范围。
本发明第三方面涉及一种试剂盒，包含酸性氯化亚锡乙醇溶液和铜盐-二乙胺乙醇溶液。
本发明第三方面的一个实施方式中，所述酸性氯化亚锡乙醇溶液中氯化亚锡的浓度为0.2～2mol/L，优选为0.5～1mol/L，更优选为0.5mol/L、0.75mol/L或1mol/L。
本发明第三方面的一个实施方式中，所述酸性氯化亚锡乙醇溶液的pH值≤6.8或≤6.2，优选为2～6.5、4～6.5或4～6，更优选为4、5.5或6。
本发明第三方面的一个实施方式中，所述酸性氯化亚锡乙醇溶液中形成酸性的物质选自盐酸溶液、硫酸溶液和硝酸溶液中的一种或多种。
本发明第三方面的一个实施方式中，所述铜盐—二乙胺乙醇溶液中铜盐的浓度为0.02～1mol/L，优选为0.04～0.8mol/L，更优选为0.05mol/L、0.1mol/L或0.75mol/L。
本发明第三方面的一个实施方式中，所述铜盐—二乙胺乙醇溶液中二乙胺的浓度为0.005～0.4mol/L，优选为0.01～0.3mol/L，更优选为0.01mol/L、0.04mol/L或0.25mol/L。
在一个实施方案中，所述铜盐为乙酸铜。
本发明第三方面的一个实施方式中，所述酸性氯化亚锡乙醇溶液的含水量≤1％(W/W)，和/或所述铜盐-二乙胺乙醇溶液的含水量≤1％(W/W)。
本发明第四方面涉及本发明第三方面任一项所述试剂盒在检测样品中的二硫代氨基甲酸酯类化合物中的用途。
本发明第四方面的一个实施方式中，所述检测为定量测定。
本发明第四方面的一个实施方式中，所述样品为固态样品；优选地，所述样品取自食品(例如农副产品)。
在一个实施方案中，所述样品取自水果(例如苹果)、烟草、烟草制品或茶叶。
本发明中，如无特别说明：
术语“磁力搅拌”是指用于搅拌或同时加热搅拌低粘稠度的液体或固液混合物的实验室常规操作。其基本原理是利用磁场的同性相斥、异性相吸的原理，使用磁场推动放置在容器中带磁性的搅拌子进行圆周运转，从而达到搅拌液体的目的。配合加热温度控制系统，可以根据具体的实验要求加热并控制样本温度，维持实验条件所需的温度条件，保证液体混合达到实验需求。
术语“烟草”是指茄科一年生或多年生草本，嗜好类作物。本属约有60多个种，大多是野生种。主要栽培种有红花烟草和黄花烟草。二者均原产南美洲，都是自然产生的双二倍体。红花烟草又称普通烟草，是世界性商品生产用烟种。又因调制方法及种源、地区、栽培措施不同而形成多种类型：烤烟、白肋烟、马里兰烟、雪茄烟、熏烟、香料烟、晒红烟、晒黄烟等。每一类型中又有很多栽培品种。黄花烟草以前苏联和印度栽培较多，中国新疆、甘肃等地有少量栽培。本属中的花烟草(N.alata Link and Otta)和粉蓝烟草(N.glauca Graham)栽种供观赏。
术语“烟草制品”是指用烟叶制造而成的嗜好性商品。根据不同类型烟叶特点，应用不同加工制造方法，生产出种类繁多的烟草制品，以满足不同消费者的嗜好要求。包括但不限于常见的卷烟。
术语“茶叶”是指茶树鲜叶经过一定工艺的制成品。含有茶多酚、咖啡碱、蛋白质、氨基酸、糖类、芳香物质和维生素等成分,有生津止渴、兴奋精神、帮助消化、利尿解毒等作用。主要产于中国、印度、斯里兰卡、日本、前苏联、印度尼西亚、土耳其、肯尼亚等五十余个国家和地区。我国现有的茶类有:绿茶、黄茶、白茶、黑茶、乌龙茶和红茶六大类。每类又分多种品名。
术语“分光光度法”是指根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法。所用的仪器为分光光度计或称吸收光谱仪。使用可见光和紫外光，即波长在200～800nm之间的光。位于可见光及紫外光区的吸收光谱仪，通常叫分光光度计。在可见光区测定有色物质主要有72型和721型分光光度计；在紫外光区用的主要有751G,53W,7520和V-340型分光光度计。分光光度法广泛应用于生物化学中,如通过比色可测有色物质的浓度和克分子消光系数等。
本发明取得的有益效果：
1、本发明前处理方法，通过样品与酸性氯化亚锡乙醇溶液的混合，分离即得到含二硫化碳的溶液，操作简便，并且，二硫化碳的提取率高，分离得到溶液的杂质含量低。
2、本发明前处理方法不在超声条件下进行，减少了二硫化碳的蒸发。
3、本发明检测方法，能准确测定出样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物含量，测定方法的稳定性高。
4、本发明检测方法的操作简便，不使用有害溶剂，安全环保。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明检测样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的流程图。
具体实施方式
实施例1
参照图1流程，设定环境温度为38.5℃，保证整个前处理与检测过程在此温度下进行。
1、样品前处理
将茶叶样品在40℃烘干24小时，称取0.5g茶叶样品装入100mL三角锥形瓶中，加入20mLpH值为6的含0.5mol/L氯化亚锡的乙醇溶液，以60转/分钟的速率磁力搅拌0.5小时，静置10分钟后，固液分离得到溶液。
2、检测
取1mL溶液，与1mL含0.05mol/L乙酸铜和0.01mol/L二乙胺的乙醇溶液进行显色反应，得到含显色物质二乙氨基二硫代甲酸铜的样品溶液。
用分光光度计测定样品溶液在272nm、302nm和332nm处的吸光度，按照下式得出校正吸光度Acorr。
其中：A272、A302、A332分别为溶液在272nm、302nm和332nm处的吸光度。
分别移取4mL、6mL、8mL、10mL、12mL二乙氨基二硫代甲酸铜标准溶液，每升二乙基二硫代氨基甲酸钠标准溶液相当于10mg二硫化碳。按上述方法用分光光度计测定并计算得到校正吸光度Acorr，绘制二硫化碳含量和校正吸光度的标准曲线，结合样品溶液的校正吸光度Acorr，计算得到茶叶样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量(以二硫化碳的含量计)，平行测定10次取平均值结果见表1。
表1
实施例2
参照图1流程，设定环境温度为40℃，保证整个前处理与检测过程在此温度下进行。
1、样品前处理
将烟末样品在40℃下烘干24小时，称取0.75g烟末样品装入100mL的三角锥瓶中，加入22.5mLpH值为5.5的含0.75mol/L氯化亚锡的乙醇溶液，以75转/分钟的速率磁力搅拌0.75小时，静置15分钟后，固液分离得到溶液。
2、检测
取1.5mL溶液，与1.5mL含0.75mol/L乙酸铜和0.25mol/L二乙胺的乙醇溶液进行显色反应，得到含显色物质二乙氨基二硫代甲酸铜的样品溶液。
参照实施例1中的方法，用分光光度法检测样品溶液中的显色物质含量。经计算得到烟末样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量(以二硫化碳的含量计)，平行测定10次取平均值结果见表2。
表2
实施例3
参照图1流程，环境温度为41.5℃，保证整个前处理与检测过程在此温度下进行。
1、样品前处理
将苹果样品在40℃下烘干24小时，称取1g苹果样品装入100mL的三角锥瓶中，加入25mLpH值为5的含1mol/L氯化亚锡的乙醇溶液，以90转/分钟的速率磁力搅拌1小时，静置20分钟后，固液分离得到溶液。
2、检测
取2mL溶液，与2mL含0.1mol/L乙酸铜和0.04mol/L二乙胺的乙醇溶液进行显色反应，得到含显色物质二乙氨基二硫代甲酸铜的样品溶液。
参照实施例1中的方法，用分光光度法检测样品溶液中的显色物质含量，经计算得到苹果样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量(以二硫化碳的含量计)，平行测定10次取平均值结果见表3。
表3
对比例1
采用行业标准YC/T405.4-2011《烟草及烟草制品多种农药残留量的测定第4部分：二硫代氨基甲酸酯农药残留量的测定气相色谱质谱联用法》中的方法分别对实施例1至3中烘干后的茶叶样品、烟末样品和苹果样品进行分析检测，得到样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量(以二硫化碳的含量计)，各平行测定10次取平均值结果见表4。
表4
对比表1-4的结果可知，本发明的前处理方法能将二硫代氨基甲酸酯类化合物反应转变成的二硫化碳更大程度地萃取出来。而且，本发明检测方法的准确度更高，稳定性更高，回收率达到97％以上。
对比例2
分别设定环境温度为30℃和50℃进行两次试验，保证整个前处理与检测过程都在所设定的温度下进行，其余操作参照实施例2进行。
根据测得的样品溶液中的显色物质含量，计算得到烟末样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量(以二硫化碳的含量计)，平行测定10次取平均值结果见表5。
表5
对比表2和表5的结果可知，在本发明的温度范围内进行前处理，能将二硫代氨基甲酸酯类化合物反应转变成的二硫化碳更大程度地萃取出来，并且，在本发明的温度范围内进行检测的准确度更高，稳定性更高，回收率达到97％以上。
对比例3
用pH值为5.5的含0.75mol/L氯化亚锡的异辛烷溶液代替实施例2中pH值为5.5的含0.75mol/L氯化亚锡的乙醇溶液，其余操作参照实施例2进行。其中，氯化亚锡的异辛烷溶液的配制方法为：将氯化亚锡溶解于异辛烷，再加入盐酸溶液调整pH值至5.5。
根据测得的样品溶液中的显色物质含量，计算得到烟末样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量(以二硫化碳的含量计)，平行测定10次取平均值结果见表6。
表6
对比表2和表6的结果可知，采用氯化亚锡的异辛烷溶液时，几乎无法检测出烟末样品中二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。