一种基于钛酸锶纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器及其制备方法与流程
本发明属于电化学生物传感器领域，尤其涉及一种基于钛酸锶纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器及其制备方法。
背景技术：
糖尿病严重危害着人类的健康，因此对于糖尿病的诊断显得尤为重要。通过检测人体血液中葡萄糖的浓度可以间接得知人们的身体健康状况，为糖尿病的诊断提供一个平台。
目前，检测葡萄糖浓度的方法有色谱法、分光光度法、旋光度法、比色法等，这些分析方法灵敏度低、费力、耗时，而使用电化学生物传感器法具有更高的灵敏度，以及分析速度快、选择性高、仪器操作简单、价格低廉等特点。近年来，电化学分析法由于其灵敏度高，特异性好，样品消耗量小、简单快速等特点，成为一种极有竞争力的葡萄糖现场检测方法。
纳米材料具有量子尺寸效应、表面-界面效应、体积效应等特点，已经被用于制备生物传感器。近几年，金属纳米粒子，碳纳米材料和聚合物纳米材料，已经被报道用于电化学葡萄糖生物传感器的制备。尽管这些材料具有良好的性能，但是存在合成方法繁琐，成本高，不易大批量制备等不足。钛酸锶(SrTiO3)是一种新型的半导体纳米材料，其制备的原材料资源丰富、成本低廉、安全性能好、无污染、制备容易等优点。此外，它还拥有大的比表面积、良好的生物相容性和导电性，可被用于固定蛋白质分子，制备生物传感器。目前，钛酸锶还没报道用于固定葡萄糖氧化酶，制备电化学生物传感器。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种基于钛酸锶纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器及其制备方法。将钛酸锶纳米粒子与葡萄糖氧化酶修饰到玻碳电极上，制得电化学生物传感器；
本发明所采用的技术方案是：本发明提供了一种基于钛酸锶纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器，是将钛酸锶纳米粒子与葡萄糖氧化酶共同修饰到玻碳电极，制得电化学生物传感器。
本发明还公开了所述的钛酸锶纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)将钛酸锶纳米粒子均匀分散在壳聚糖溶液中，再加入葡萄糖氧化酶，配制成葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液；
2)将步骤1)中制得的葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液均匀涂覆到经过预处理的玻碳电极表面，置于4℃的温度环境下，干燥后即得到所述电化学葡萄糖生物传感器。
所述步骤1)中，钛酸锶纳米粒子的制备过程如下：a)称取一定物质的量的二氧化锶、一定物质的量的二氧化钛(P25)及等摩尔的氯化钠和氯化钾，在研钵中混合并研磨均匀，转移至坩埚中；b)在马弗炉中把坩埚加热到700℃，保持该温度10h,然后冷却至室温后用1M的硝酸和去离子水彻底清洗，除去杂质，在空气中80℃烘干，收集钛酸锶纳米粒子待用。
所述步骤2)中，对玻碳电极的预处理方法如下：将玻碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm的氧化铝粉抛光，再用去离子水冲洗残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干。
一种利用本发明的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)在测试液中，以制得的电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，加入葡萄糖样本；
(2)然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。
在步骤(1)中，检测条件是：所述测试液为磷酸缓冲盐0.02-0.1mol L-1的溶液；所述磷酸缓冲盐PBS溶液，其pH值为6.5-7.5。
本发明的有益效果：本发明的传感器制备简单、快速、成本低、灵敏度高，稳定性好，可以用于葡萄糖浓度的检测。而且，采用钛酸锶纳米粒子固定葡萄糖氧化酶，可以很好地保持生物大分子的生物催化活性。该传感器通过循环伏安法检测葡萄糖浓度，可将其应用于葡萄糖电化学分析。本发明具有如下优点：
1.本发明采用不同条件下制备的钛酸锶纳米粒子，钛酸锶纳米材料具有比表面积大、生物相容性好、导电性好等优点，利用其固定葡萄糖氧化酶，有利于保持酶的生物活性，提高检测时的电子传递速率，拓宽检测的线性范围。制备的纳米材料电化学葡萄糖传感器可实现对葡萄糖的定量检测，灵敏度高、稳定性好。
2、本发明电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，制备简单、快速、成本低、灵敏度高，可以用于实际样品中葡萄糖浓度的检测。该传感器通过安培检测得到的i–t曲线来检测葡萄糖浓度，可将其应用于葡萄糖电化学分析。
3、利用本发明的传感器置于检测体系中，加入葡萄糖，检测其电化学信号。测试方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于人体血糖葡萄糖浓度的检测。为了提高检测的准确性，本发明还在涂覆钛酸锶纳米材料的混合溶液前，将玻碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干，以此制得预处理的玻碳电极。
4、本发明检测方法，对缓冲溶液的pH、安培检测中的电位进行了优化，并获得了最佳的葡萄糖检测条件，提高了分析效果。该方法简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，用于检测人体血糖浓度，有助于糖尿病的检测，为人类健康提供保障。
附图说明
图1是钛酸锶纳米粒子(A)、钛酸锶纳米粒子和壳聚糖的溶液(B)修饰到玻碳电极上干燥后的扫描电镜图(SEM)；
图2是GOD/SrTiO3/CS修饰电极在0.1M pH 7.0PBS中，连续加入葡萄糖不同浓度的得到的i-t安培响应曲线；
具体实施方式
下面对本发明的实验过程进行详细的说明，旨在使本发明的设计流程、设计目的及其创新点和优点更加明了。
一、制备工艺：
实施例1
本发明提供一种钛酸锶纳米材料的制备方法，将钛酸锶纳米材料与葡萄糖氧化酶修饰到玻碳电极上，制得电化学生物传感器。
本发明所述的钛酸锶纳米粒子的电化学葡萄糖生物传感器的制备方法，步骤如下：
(1)制备钛酸锶纳米颗粒，通过如下步骤：
a)称取一定物质的量的二氧化锶、一定物质的量的二氧化钛(P25)及等摩尔的氯化钠和氯化钾，在研钵中混合并研磨均匀，转移至坩埚中；
b)在马弗炉中把坩埚加热到700℃，保持该温度10h,然后冷却至室温后用1M的硝酸和去离子水彻底清洗，除去杂质，在空气中80℃烘干，收集钛酸锶纳米粒子待用。
(2)在超声条件下，将1.0-3.0mg钛酸锶纳米粒子(SrTiO3)分散在1.0mL 0.5％的壳聚糖(CS)溶液中，形成钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液。
(3)将玻碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干，制得预处理的玻碳电极。
(4)向钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液中加入葡萄糖氧化酶，使其混合均匀，配制葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液(即：GOD/SrTiO3/CS混合溶液)。然后将制得的含有葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖(GOD/SrTiO3/CS)的混合溶液3.0-7.0μL均匀地涂覆于预处理的玻碳电极(d＝2-4mm)表面，置于4℃的温度环境下，干燥后制得GOD/SrTiO3/CS修饰电极。
利用前述制备方法得到的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)在测试液中，以制得的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，加入葡萄糖样本；
(2)然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。
所述的检测方法，在步骤(1)中，检测条件是：所述测试液为磷酸缓冲盐0.02-0.1mol L-1的溶液(即PBS溶液)；所述磷酸缓冲盐PBS溶液，其pH值为6.5-7.5。
本发明利用纳米材料的特殊性能来控制酶的活性，采用SrTiO3纳米粒子以及壳聚糖的生物兼容性构建了一种生物传感器。下述实验说明，本发明基于GOD/SrTiO3/CS修饰GCE的生物传感器不但对葡萄糖有良好的催化活性，而且重复性及稳定性很好。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：制备钛酸锶纳米颗粒，通过如下步骤：
a)称取一定物质的量的二氧化锶、一定物质的量的二氧化钛(P25)及等摩尔的氯化钠和氯化钾，在研钵中混合并研磨均匀，转移至坩埚中(二氧化锶、二氧化钛的物质的量之比为2:1，1:1，1:2)；
b)在马弗炉中把坩埚加热到700℃，保持该温度10h,然后冷却至室温后用1M的硝酸和去离子水彻底清洗，除去杂质，在空气中80℃烘干，收集钛酸锶纳米粒子待用。
(2)在超声条件下，将1.0-3.0mg钛酸锶纳米粒子(SrTiO3)分散在1.0mL 0.5％的壳聚糖(CS)溶液中，形成钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液。
(3)将玻碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干，制得预处理的玻碳电极。
(4)向钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液中加入葡萄糖氧化酶，使其混合均匀，配制葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液(即：GOD/SrTiO3/CS混合溶液)。然后将制得的含有葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖(GOD/SrTiO3/CS)的混合溶液3.0-7.0μL均匀地涂覆于预处理的玻碳电极(d＝2-4mm)表面，置于4℃的温度环境下，干燥后制得GOD/SrTiO3/CS修饰电极。
利用前述制备方法得到的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)在测试液中，以制得的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，加入葡萄糖样本；
(2)然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。
所述的检测方法，在步骤(1)中，检测条件是：所述测试液为磷酸缓冲盐0.02-0.1mol L-1的溶液(即PBS溶液)；所述磷酸缓冲盐PBS溶液，其pH值为6.5-7.5。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：制备钛酸锶纳米颗粒，通过如下步骤：
a)称取一定物质的量的二氧化锶、一定物质的量的二氧化钛(P25)及等摩尔的氯化钠和氯化钾，在研钵中混合并研磨均匀，转移至坩埚中(二氧化锶、二氧化钛的物质的量之比为1：1)；
b)在马弗炉中把坩埚加热到800℃，保持该温度10h,然后冷却至室温后用1M的硝酸和去离子水彻底清洗，除去杂质，在空气中80℃烘干，收集钛酸锶纳米粒子待用。
(2)在超声条件下，将1.0-3.0mg钛酸锶纳米粒子(SrTiO3)分散在1.0mL 0.5％的壳聚糖(CS)溶液中，形成钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液。
(3)将玻碳电极依次用粒径0.3μm和0.5μm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，修饰前用氮气快速吹干，制得预处理的玻碳电极。
(4)向钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液中加入葡萄糖氧化酶，使其混合均匀，配制葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖混合溶液(即：GOD/SrTiO3/CS混合溶液)。然后将制得的含有葡萄糖氧化酶/钛酸锶纳米粒子/壳聚糖(GOD/SrTiO3/CS)的混合溶液3.0-7.0μL均匀地涂覆于预处理的玻碳电极(d＝2-4mm)表面，置于4℃的温度环境下，干燥后制得GOD/SrTiO3/CS修饰电极。
利用前述制备方法得到的电化学葡萄糖生物传感器对葡萄糖样本进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)在测试液中，以制得的修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂片电极作为对电极，加入葡萄糖样本；
(2)然后用电化学工作站检测工作电极的电化学信号。
所述的检测方法，在步骤(1)中，检测条件是：所述测试液为磷酸缓冲盐0.02-0.1mol L-1的溶液(即PBS溶液)；所述磷酸缓冲盐PBS溶液，其pH值为6.5-7.5。
二、制成的产物特征：
参见图1，图1(A)是采用本发明制备的钛酸锶的SEM图，图1(B)则是用壳聚糖分散钛酸锶的SEM图,由图可见，壳聚糖可以均匀分散钛酸锶，并且能形成稳固的膜。壳聚糖具有较好的成膜能力和生物相容性、无毒性、良好的机械强度和透水性等特点，现已被广泛用于分散纳米材料和固定蛋白质分子，从而构建生物传感器。
图2是GOD/SrTiO3/CS/GCE在连续搅拌、空气饱和的0.1M pH 7.0的PBS缓冲液中连续滴加不同浓度的葡萄糖溶液得到的i-t安培响应曲线。电压为-0.5V，内插图：响应信号与葡萄糖浓度的关系。峰电流(Ipa，μA)与葡糖糖的浓度在1×10-5-1.2×10-3mol·L-1范围内呈良好的线性关系，检测限为3μM(S/N＝3)。其关系曲线的方程为y＝0.04755+0.0011x，灵敏度为15.6mA·M-1·cm-2，米氏常数为0.1mM。
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