一种同时分离和测定唾液中多种酚类物质的方法与流程

本发明属于分析化学
技术领域：
，具体涉及一种同时分离和测定唾液中多种酚类物质的方法。
背景技术：
：苯酚、苯二酚、甲基苯酚等，它们不但有较难闻的气味，还对皮肤及呼吸道黏膜有强烈的刺激作用和致癌作用。另一些酚类，如丁香酚、2-甲氧基-4-甲基-苯酚，有强烈的香气，是香精中的重要配方之一。这些酚类物质大量存在于卷烟主流烟气中，可通过烟草吸食者、被动吸烟者的唾液溶解吸收，进而对人体产生影响。此外，大量暴露于酚类物质的人体唾液中可能存在酚类，大量吸入酚类物质而引发的酚类物质中毒者唾液中也可能存在酚类物质。因此研究测定人体唾液中吸收溶解的酚类成分，不仅可为吸烟与健康的评估提供数据支持，还可用于评价酚类物质的人体暴露量，或者用于检测酚类中毒。目前，测定不同基质、样品中酚类物质已有大量报道，然而唾液样品中多种酚类物质的测定还未见报道。酚类物质常用的测定方法有气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法。但采用气相色谱-质谱联用法测定酚类物质易氧化或受热分解，通常需要进行衍生化处理，操作十分繁琐，影响测定结果的准确性。采用常规的高效液相色谱法测定时，同时测定的目标物少，分离时间长，且前处理过程繁琐。因此，开发简单快速、分离效果好、高通量、高灵敏度、定量准确的唾液中多种酚类物质的分离和测定方法非常迫切。技术实现要素：本发明的目的在于针对目前唾液中多种酚类物质分离和测定的方法未见文献报道的现状，以及现有技术的不足，提供一种同时分离和测定唾液中多种酚类物质的方法，该方法分离效果好，检出限低，精密度好，准确可靠，具有推广应用价值，基于实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种同时分离和测定唾液中多种酚类物质的方法，包括以下步骤：步骤(1)，样品采集：将唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼后放回收集管，经离心后，得到唾液样品；所述的咀嚼时间为1-3min；步骤(2)，样品酸化：移取唾液样品于样品管中，依次加入酸化剂、内标物，然后经涡旋振荡至混合均匀，得到酸化液；所述的酸化剂为乙酸，所述的酸化剂用量为唾液体积的0.5％-2％；所述的内标物为4-氟苯酚，浓度为0.1-10mg/L；步骤(3)，测定：将步骤(2)得到的酸化液，过0.22μm微孔滤膜，采用超高效液相色谱-多波长荧光法分离和测定唾液中的多种酚类物质，内标法定量，根据标准曲线计算各酚类物质的含量；所述的多种酚类物质包括对苯二酚、间苯二酚、邻甲基对苯二酚、邻苯二酚、苯酚、4-甲基苯酚、2-甲基苯酚、2-甲氧基-4-甲基-苯酚、2,6-二甲基苯酚、2-乙基苯酚和丁香酚；所述超高效色谱条件如下：色谱柱：C18反相色谱柱或等效柱，C18反相色谱柱的规格为长度×内径是100mm×2.1mm，粒径为1.7μm；流速为0.1-0.4mL/min；柱温为30-60℃；进样量为1-3μL；流动相A为体积浓度为0.5-2％的乙酸水溶液，流动相B为乙酸、乙腈和水的混合溶液，流动相B乙酸浓度与流动相A中乙酸浓度相同，乙腈体积浓度为25-50％，梯度洗脱；梯度洗脱条件为：第0min，流动相A70-95％，流动相B30-5％；第6-12min任意一时刻改变流动相浓度配比，改变后的流动相A为0％，流动相B为100％；第15min停止洗脱；具体见下表1：表1时间(min)流动相A(％)流动相B(％)070-9530-56-12任意一时刻0100150100所述多波长荧光法的荧光检测器的波长选择见下表2：表2化合物激发波长(nm)发射波长(nm)对苯二酚280-300320-335间苯二酚270-280295-315邻甲基对苯二酚290-300320-330邻苯二酚270-280305-320苯酚260-280295-3104-甲基苯酚270-280300-3252-甲基苯酚265-275295-3252-甲氧基-4-甲基-苯酚270-280305-3152,6-二甲基苯酚265-275295-3052-乙基苯酚265-275295-305丁香酚270-280305-3154-氟苯酚(内标)270-280305-315进一步，优选的是，步骤(1)中唾液离心转速不低于10000rpm，离心时间不少于10min。进一步，优选的是，步骤(2)中唾液移取量为0.5-5mL。进一步，优选的是，步骤(2)中涡旋振荡转速为500-20000rpm，涡旋振荡时间为0.5-10min。进一步，优选的是，步骤(3)中标准曲线绘制方法如下：配制多种酚类物质的5级混合标准溶液，浓度分别为0.05mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、10mg/L、25mg/L，5级混合标准溶液中均加入内标物，内标物浓度与唾液样品中加入内标浓度相同，内标物浓度为0.1-10mg/L，对5级混合标准溶液进行超高效液相色谱-多波长荧光法分析，根据各酚类物质响应峰面积与内标物响应峰面积的比值为纵坐标，以各酚类物质浓度与内标物浓度比值为横坐标，作各酚类物质的标准曲线。超高效液相色谱-多波长荧光法分析中的条件与前述超高效液相色谱-多波长荧光法中的条件相同。本发明与现有技术相比，其有益效果为：(1)本发明方法可以有效用于同时分离和测定唾液中多种酚类物质，包括11种不同取代的苯酚和苯二酚类物质；(2)样品只需酸化处理即可进样分析，操作简便，避免了常用的固相萃取、液液萃取、衍生化或浓缩等前处理技术多步骤处理过程中造成的目标物损失、氧化、变性，提高测定准确性。(3)采用多波长检测，可选择的波长范围广，可在10-20nm波长范围内灵活选择波长，并获得高灵敏度；(4)采用4-氟苯酚作为内标进行整个分析过程的校正，回收率高，定量准确可靠，进一步有效的提高了准确性。总的来说，该方法不仅可以同时有效的分离和测定唾液中多种酚类物质，而且方法操作简便，分离效果好，检出限低，精密度好，准确可靠，具有推广应用价值。以上说明为本发明技术方案的概述，为了更清楚的了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，现特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。附图说明图1是本发明测定多中酚类物质标准溶液的液相色谱分离图；图2为唾液加标样品的液相色谱分离图。图3为烟草吸食者唾液样品的液相色谱分离图。图中各峰的含义如下：1，1.60min，对苯二酚；2，2.41min，间苯二酚；3，2.65min，邻甲基对苯二酚；4，3.25min，邻苯二酚；5，5.38min，苯酚；6，8.36min，4-甲基苯酚；7，8.59min，2-甲基苯酚；8，9.32min，2-甲氧基-4-甲基-苯酚；9，11.37min，2,6-二甲基苯酚；10，11.89min，2-乙基苯酚；11，13.68min，丁香酚；IS，6.57min，4-氟苯酚。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但其并不限制本发明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1一种分离和测定烤烟吸食者唾液中多种酚类物质的方法，包括以下步骤：(1)样品采集：将唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼2min后放回收集管，于10000rpm转速下离心15min后，得到唾液样品；(2)样品酸化：移取0.5mL唾液样品于样品管中，加入0.01mL乙酸、并加入4-氟苯酚内标并使其浓度为3mg/L，经2000rpm转速下涡旋振荡2min至混合均匀；(3)测定：将步骤(2)得到的酸化液，过微孔滤膜，采用超高效液相色谱-多波长荧光法测定，内标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。超高效色谱条件如下：色谱柱：C18反相色谱柱，规格为长度×内径是100mm×2.1mm，粒径为1.7μm；流速为0.3mL/min；柱温为50℃；进样量为2μL；流动相A为体积浓度为1％的乙酸水溶液，流动相B为乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸体积浓度1％，乙腈体积浓度为25％，梯度洗脱；梯度洗脱条件为：第0min，流动相A90％，流动相B10％；第10min改变流动相浓度配比，改变后的流动相A为0％，流动相B为100％；第15min停止洗脱；梯度洗脱条件见下表3：表3时间(min)流动相A(％)流动相B(％)09010100100150100所述多波长荧光法的荧光检测器的波长选择见下表4：表4表5线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率n表示实验重复次数。酚类物质混合标准溶液的液相色谱分离图如图1所示，11种酚类和内标物实现完全分离，峰形尖锐对称；唾液加标样品的液相色谱分离图如图2所示，11种酚类和内标物不受唾液基质的影响，均实现完全分离；烟草吸食者唾液样品的液相色谱分离图如图3所示，检测出的酚类物质分离良好，不受唾液基质干扰，能实现准确定量。表5给出了实施例1方法分析烤烟吸食者唾液中酚类物质的线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率相关参数，上述数据表明该方法结果可靠，精密度好，适合于烤烟吸食者唾液中酚类物质的分离和测定。实施例2一种分离和测定雪茄烟吸食者唾液中多种酚类物质的方法，包括以下步骤：(1)样品采集：将唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼1min后放回收集管，于12000rpm转速下离心12min后，得到唾液样品；(2)样品酸化：移取2.0mL唾液样品于样品管中，加入0.03mL乙酸、并加入4-氟苯酚内标并使其浓度为1.5mg/L，经20000rpm转速下涡旋振荡0.5min至混合均匀；(3)测定：将步骤(2)得到的酸化液，过微孔滤膜，采用超高效液相色谱-多波长荧光法测定，内标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。超高效色谱条件如下：色谱柱：C18反相色谱柱，规格为长度×内径是100mm×2.1mm，粒径为1.7μm；流速为0.1mL/min；柱温为30℃；进样量为3μL；流动相A为体积浓度为1.5％的乙酸水溶液，流动相B为乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸体积浓度1.5％，乙腈体积浓度为50％，梯度洗脱；梯度洗脱条件为：第0min，流动相A70％，流动相B30％；第6min改变流动相浓度配比，改变后的流动相A为0％，流动相B为100％；第15min停止洗脱；梯度洗脱条件见下表6：表6时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0703060100150100所述多波长荧光法的荧光检测器的波长选择见下表7：表7表8线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率n表示实验重复次数。表8给出了实施例2方法分析雪茄烟吸食者唾液中酚类物质的线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率相关参数，上述数据表明该方法结果可靠，精密度好，适合于雪茄烟吸食者唾液中酚类物质的分离和测定。实施例3一种分离和测定香精配方员唾液中多种酚类物质的方法，包括以下步骤：(1)样品采集：将唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼3min后放回收集管，于15000rpm转速下离心10min后，得到唾液样品；(2)样品酸化：移取5.0mL唾液样品于样品管中，加入0.025mL乙酸、并加入4-氟苯酚内标并使其浓度为10mg/L，经500rpm转速下涡旋振荡10min至混合均匀；(3)测定：将步骤(2)得到的酸化液，过微孔滤膜，采用超高效液相色谱-多波长荧光法测定，内标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。超高效色谱条件如下：色谱柱：C18反相色谱柱，规格为长度×内径是100mm×2.1mm，粒径为1.7μm；流速为0.25mL/min；柱温为30℃；进样量为1μL；流动相A为体积浓度为0.5％的乙酸水溶液，流动相B为乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸体积浓度0.5％，乙腈体积浓度为40％，梯度洗脱；梯度洗脱条件为：第0min，流动相A95％，流动相B5％；第9min改变流动相浓度配比，改变后的流动相A为0％，流动相B为100％；第15min停止洗脱；梯度洗脱条件见下表9：表9时间(min)流动相A(％)流动相B(％)095590100150100所述多波长荧光法的荧光检测器的波长选择见下表10：表10时间(min)激发波长(nm)发射波长(nm)对苯二酚300335间苯二酚280315邻甲基对苯二酚300330邻苯二酚280320苯酚2803104-甲基苯酚2803252-甲基苯酚2753252-甲氧基-4-甲基-苯酚2803152,6-二甲基苯酚2753052-乙基苯酚275305丁香酚2803154-氟苯酚(内标)280315表11线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率n表示实验重复次数。表11给出了实施例3方法分析香精配方员唾液中酚类物质的线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率相关参数，上述数据表明该方法结果可靠，精密度好，适合于香精配方员唾液中酚类物质的分离和测定。实施例4一种分离和测定口含烟食用者中多种酚类物质的方法，包括以下步骤：(1)样品采集：将唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼2.5min后放回收集管，于20000rpm转速下离心10min后，得到唾液样品；(2)样品酸化：移取3.0mL唾液样品于样品管中，加入0.03mL乙酸、并加入4-氟苯酚内标并使其浓度为0.1mg/L，经15000rpm转速下涡旋振荡1min至混合均匀；(3)测定：将步骤(2)得到的酸化液，过微孔滤膜，采用超高效液相色谱-多波长荧光法测定，内标法定量，根据标准曲线计算目标物含量。超高效色谱条件如下：色谱柱：C18反相色谱柱，规格为长度×内径是100mm×2.1mm，粒径为1.7μm；流速为0.2mL/min；柱温为30℃；进样量为1μL；流动相A为体积浓度为2％的乙酸水溶液，流动相B为乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸体积浓度2％，乙腈体积浓度为35％，梯度洗脱；梯度洗脱条件为：第0min，流动相A80％，流动相B20％；第12min改变流动相浓度配比，改变后的流动相A为0％，流动相B为100％；第15min停止洗脱；梯度洗脱条件见下表12：表12时间(min)流动相A(％)流动相B(％)08020120100150100所述多波长荧光法的荧光检测器的波长选择见下表13：表13时间(min)激发波长(nm)发射波长(nm)对苯二酚290330间苯二酚278310邻甲基对苯二酚295325邻苯二酚278318苯酚2753084-甲基苯酚2773202-甲基苯酚2723212-甲氧基-4-甲基-苯酚2783122,6-二甲基苯酚2723022-乙基苯酚272302丁香酚2783124-氟苯酚(内标)278312表14线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率n表示实验重复次数。表14给出了实施例4方法分析口含烟食用者唾液中酚类物质的线性相关系数、精密度(RSD)、检出限、定量限和回收率相关参数，上述数据表明该方法结果可靠，精密度好，适合于口含烟食用者唾液中酚类物质的分离和测定。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3