基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法及其应用与流程
本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的血红蛋白生物传感器电极的制备方法及其应用。
背景技术：
大肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，占全部胃肠道癌的首位，目前其发病率有逐年增高趋势。根据国家肿瘤登记中心报道，1991年至2005年结直肠癌发病率是上升速度最快的三种肿瘤之一。在西方社会的发病率更高，据近年统计每20位成年人中便有一例大肠癌患者。国外数据显示，开展结直肠癌筛查可以发现癌前疾病，经过适当的干预，有效降低肿瘤的发病率和病死率。虽然诊断技术不断发展，但由于大肠癌的早期症状易被忽略，故很多患者在确诊时已经偏晚，严重影响预后，因此积极提高大肠癌的早期诊断率已是当务之急。
粪便隐血诊断是筛查早期大肠癌患者的重要手段之一。隐血一般是指消化道出血量很少肉眼看不见的血色，而其少量红细胞又被分解消化以致镜下也无从发现的出血状况而言。粪便隐血检查对消化道出血的诊断有重要价值，在消化道溃疡时阳性率约为40％～70％呈间断性阳性。消化道癌肿时阳性率可达95％，呈持续性阳性，故粪便隐血检验已被用作消化道恶性肿瘤的诊断筛选指标。
目前，常用的化学法隐血试验的原理为血红蛋白中的含铁血红素部分，该种蛋白有类似过氧化物酶作用，能催化试剂中的过氧化氢分解，释放新生态氧，新生态氧可氧化各种色原物质(如：邻联甲苯胺、匹拉米洞、愈创木酯等)而呈色。色调深浅与血红蛋白的多少，出血量的大小成正比，其中邻联甲苯胺法是最常用。化学法隐血试验虽简易可行，但特异性、准确性均差。
为了解决上述问题，近年来建立了多种免疫学方法来助诊消化道出血及筛查早期大肠癌。虽然免疫学方法使血红蛋白的检出率比化学法可提高一倍以上，但通常给出的结果是定性的结果，而非定量值，且当血红蛋白高过某一极限值时还会给出假阴性结果，造成严重的漏检结果，以至延误病情。因此，目前迫切需要一种快速、准确、定量、简便的方法来检验便隐血，电化学检验血红蛋白的方法就可以满足这一要求。
众所周知血红蛋白(hb)是脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白，是血液中运输氧气的主要物质，是由两条α和两条β多肽链构成的四聚体，每个肽链上各结合有一个血红素分子，且相互接近，形成近似球形的血红蛋白分子，直径为55nm。血红素位于肽链折叠形成的介电常数较低的疏水环境中，铁离子以共价键形式与卟啉的四个吡咯环中的n原子以及肽链中的组氨酸相连接。综上所述，由于血红蛋白分子的空间结构庞大，电活性中心不容易暴露，而且易于吸附在电极表面而使固体电极表面钝化，同时其过电位较高，在电极上电子转移速率很慢，难以得到有效的电化学信号，且其相对分子质量较大，在溶液中的浓度通常较低，产生的氧化还原电流较小，其电信号易被充电电流、残余电流等背景电流所掩盖，如在玻碳电极上就无明显的电化学信号，所以早期以各种裸电极对其进行研究和测定并不成功。
为了改善血红蛋白电极反应的可逆性，加速其在电极上交换电子的速率，活化其氧化还原中心，有人采用各种促进剂来加快血红蛋白的电极反应过程。促进剂是一类非电活性的物质，其本身在电极上并无反应，但易于吸附在电极表面，它的存在可以加速血红蛋白在电极上交换电子的速度。原因可能是表面活性剂与血红蛋白相互作用形成复合物而使hb的多肽链伸展开来，其疏水结构被打开使电活性中心暴露而加快了电子转移的速率。更多的报道是以各种染料作为媒介体的修饰电极对hb的电化学性质进行的研究。许多种染料被用做媒介体来对血红蛋白进行研究，它们主要起到电极与血红蛋白之间传递电子的作用。但这些研究多集中在血液中血红蛋白的浓度检验，用于检查与血红蛋白浓度相关的疾病，而没有人提出采用电化学检验血红蛋白浓度的方法来检验便隐血。电化学测试方法方便快捷，且能给出定量的结果。但是便隐血的浓度通常较低，用肉眼是难于观察到的，所以需要一个富集再直接电化学测定的过程。
近年来出现的新兴碳材料石墨烯具有独特的结构和优异的性能，它具有非常高的机械强度、大的比表面积以及极强的电子传输能力，且成本低廉，可加工性好；对于待测物质具有一定的电催化作用，可以实现良好的重现性和可再生性。石墨烯大的比表面积对血红蛋白具有富集作用，而石墨烯的生物相容性使血红蛋白在其表面将多肽链伸展开来，疏水结构被打开使电活性中心暴露而加快了电子转移的速率，因此实现了血红蛋白与电极的直接电子转移。综上所述，石墨烯的高导电性和高电子传导速率可以实现血红蛋白的活性中心的直接电子传递，石墨烯修饰电极有望用于便隐血的检验。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于石墨烯的第三代血红蛋白传感器电极的制备方法及其应用，采用石墨烯材料既利于血红蛋白的吸附与铺展又能实现其与电极直接电子传递，生物传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，具有较强的抗干扰能力，可广泛地用于疑似胃肠道恶性肿瘤病人的便潜血筛查。
本发明的技术方案是：
一种基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，包括如下步骤：
(1)石墨烯修饰电极的制备
将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；
(2)修饰电极上氧化石墨烯的还原
将步骤(1)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2m磷酸盐缓冲溶液溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在电化学工作站上在-1.5～0v电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对血红蛋白的吸附性能，促进血红蛋白与电极的直接电化学反应。
所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，步骤(1)中，为了提高修饰电极的稳定性，再滴涂壳聚糖溶液即得到所要制备的修饰电极。
所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，壳聚糖溶液采用浓度为0.1～0.5wt％的壳聚糖醋酸溶液。
所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.05mg/ml～5mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯溶液的量为0.5～20μl。
所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，优选的，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.5～3mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯溶液的量为2～15μl。
所述方法制备的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的应用，血红蛋白生物传感器电极用于检测血红蛋白，检测粪便中的血红蛋白，检测尿中的血红蛋白。
所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的应用，石墨烯修饰电极传感器对血红蛋白溶液浓度的检测过程如下：
将修饰电极与银/氯化银电极和铂片电极构成三电极体系，在摩尔浓度为0.05～0.1m的h2so4溶液中加入血红蛋白构成电解液，在电化学工作站上在-0.65～0.4v电压范围内做循环伏安cv扫描，在cv曲线上的氧化还原峰电流随血红蛋白浓度呈规律性变化，从而实现对血红蛋白浓度的测试。
本发明的设计思想是：
本发明将石墨烯与壳聚糖复合作为电极的修饰层，石墨烯优异的生物相容性和导电性能有助于实现血红蛋白与电极的直接电子传递，石墨烯优异的生物相容性可使团聚的血红蛋白分子在其表面铺展，使其电活性部分血红素暴露出来，实现血红蛋白与电极的直接电子转移，即实现血红蛋白的直接检测。以上述的石墨烯修饰电极为工作电极，银/氯化银为参比电极，铂片电极为对电极构成的传感器，可实现血红蛋白的快速、灵敏、定量的测定。
与现有的便隐血测试方法相比较，本发明具有如下优势：
1、本发明所述的新型石墨烯修饰电极使用了化学氧化法制备的氧化石墨烯，该氧化石墨烯通常含有较丰富的含氧官能团，即使经电化学还原后，仍保留一定量的含氧官能团(包括羰基，羟基和羧基等)，这些官能团有助于石墨烯与血红蛋白的相互作用。研究结果表明石墨烯的表面带负电荷，而血红蛋白带正电荷，二者有较强的静电吸引作用，使血红蛋白易于吸附在石墨烯表面。这些可提高石墨烯对血红蛋白的富集和直接电化学反应的作用，因此显著地提高该修饰电极检测血红蛋白的灵敏度。
2、本发明所述的新型石墨烯修饰电极上由于使用了壳聚糖，壳聚糖的优良生物相容性对血红蛋白在电极上的吸附和生物活性的保持也具有促进作用。同时壳聚糖在电极上形成的保护膜对其他杂质给电极造成的污染有阻隔作用，因此该修饰电极具有较强的专一性，保证了构建的血红蛋白传感器的稳定性和专一性。
3、本发明所述的新型血红蛋白测试电极上仅修饰了氧化石墨烯，没有使用其它电活性染料作为电子媒介体，因此简化了制备工艺，降低了制备成本，同时还提高了电极的稳定性。
4、本发明提供的修饰电极的制备方法简单，石墨烯具有优异的导电性能和良好的生物相容性，利于血红蛋白在其表面吸附并实现与电极的直接电子传递。该石墨烯修饰电极具有良好的血红蛋白检测性能，表现出高的灵敏度、宽的检测范围、良好的抗干扰性质等特点，可用于制备新型便隐血传感器。本发明制备方法简单易行，易于实现规模化生产。因此，本发明既具有重要的学术价值又具有实用价值。
附图说明
图1.裸玻碳电极与石墨烯修饰玻碳电极在0.06m(mol/l)h2so4的循环伏安曲线。其中，gc为玻碳电极；gns-gc为石墨烯修饰玻碳电极。
图2(a)-图2(b).石墨烯修饰电极在含血红蛋白(chb＝2μg/ml)的溶液中，在不同电位扫描速率(100、150、200、250、300、350、400mv/s)下的循环伏安曲线(图2(a))及还原峰电流与电位扫描速率的关系曲线(图2(b))。
图3.石墨烯(修饰量2微升，浓度1mg/ml)修饰电极测试不同浓度血红蛋白的循环伏安曲线(1、2、3、5、10μg/ml)
图4.石墨烯(修饰量5微升，浓度1mg/ml)修饰电极测试不同浓度血红蛋白的循环伏安曲线(1、2、3、5、10μg/ml)
具体实施方式
在具体实施过程中，本发明提出的一种基于石墨烯的第三代血红蛋白传感器的制备方法，首先是将氧化石墨烯溶液滴涂到经清洁后的传感器电极上，经电化学还原将氧化石墨烯转化为石墨烯，以实现血红蛋白的直接电子转移和电极表面的活性吸附及富集。然后将壳聚糖溶液滴涂到电极表面，经室温干燥后即得到修饰有石墨烯的血红蛋白传感器电极。壳聚糖的作用是防止石墨烯脱落到电解液中，提高传感器的稳定性。该方法具体步骤如下：
(1)石墨烯的第三代血红蛋白传感器的制备：
玻碳电极的预处理：首先将玻碳电极
(2)修饰电极的制备：
(a)配制浓度为1mg/ml氧化石墨烯pbs溶液(磷酸缓冲盐溶液)，用移液器取1μl的上述氧化石墨烯溶液滴加到经抛光处理好的玻碳电极的表面，室温下晾干。
(b)配制浓度为0.2wt％壳聚糖的醋酸溶液，用移液器取5μl壳聚糖溶液滴加到经步骤a)修饰的电极上，室温下晾干。
(c)上述的修饰有氧化石墨烯的电极作为工作电极，在以0.1m磷酸盐缓冲溶液(ph＝7)为电解液，甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极构成三电极体系，采用循环伏安法将氧化石墨烯电化学还原成石墨烯。即得到石墨烯修饰的血红蛋白传感器电极，最后在电化学工作站上采用循环伏安法进行血红蛋白浓度的测试。
为了使本发明的内容更容易理解，下面结合具体实施方法对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于这些。
实施例1
首先分别配制浓度为1mg/ml氧化石墨烯的pbs溶液，浓度为0.2wt％的壳聚糖乙酸溶液。然后对表面经抛光处理的电极1进行修饰，首先在电极上滴加1μl的上述氧化石墨烯溶液，待电极室温干燥后，再滴加5μl的0.2wt％壳聚糖溶液。待电极干燥后，将该电极插入0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液中浸泡2小时，以除去与电极结合不牢固的氧化石墨烯，最后制得氧化石墨烯修饰电极。以上述的修饰电极作为工作电极，并与饱和甘汞电极(参比电极)和铂片电极(对电极)构成三电极体系，以0.lmol/l的磷酸盐缓冲溶液作为电解液，采用循环伏安法进行电化学还原，得到石墨烯修饰电极1。另取表面经抛光处理的玻碳电极作为电极2以上述二电极分别作为工作电极，银/氯化银为参比电极，铂片电极为对电极构成三电极体系，以0.06m硫酸为电解液，在电化学工作站上做循环伏安测试，从得到循环伏安曲线上(图1)可以看出，石墨烯修饰电极在循环伏安曲线有明显的还原峰，而裸玻碳电极则无还原峰，证明石墨烯修饰电极可实现血红蛋白的检测。
实施例2
石墨烯修饰电极的制备方法同实施例1，为了考察血红蛋白在石墨烯修饰电极上的电极反应过程，将该修饰电极作为工作电极与银/氯化银参比电极，铂片电极对电极构成三电极体系，以含2μg/ml血红蛋白的0.06m硫酸为电解液，在不同扫描速度下测试了循环伏安曲线，结果见图2，从图中可看出循环伏安曲线上的还原峰电流与电压扫描速率成正比，说明该电极过程是由电极表面电子传递过程控制的，即吸附过程控制。
实施例3
石墨烯修饰电极制备方法同实施例1，只是氧化石墨烯的修饰量为2μl。以该电极为工作电极，银/氯化银为参比电极，铂片电极为对电极构成三电极体系，以0.06m硫酸和不同浓度的血红蛋白(1μg/ml，2μg/ml……10μg/ml)为电解液，在电化学工作站上做循环伏安测试，从得到循环伏安曲线上(图3)可以看出，还原峰电流随血红蛋白浓度提高而提高，证明石墨烯修饰电极可实现血红蛋白的检测。
对比例1
工作电极修饰方法同实施例1，只是修饰电极所用的氧化石墨烯的用量不同，由实施例1的2微升改为5微升，再测试相同浓度的血红蛋白，所得到的循环伏安曲线见图4，从获得的循环伏安曲线上可得出于与实施1完全不同的实验结果，即还原峰电流不随血红蛋白浓度升高而升高，而是变得没有规律。这是因为石墨烯修饰量过多，会使得到的还原峰电流峰值明显升高，较低浓度的血红蛋白不足以引起石墨烯的还原峰电流的改变，所以低浓度的血红蛋白与还原峰电流无相关性，也就不能实现低浓度的血红蛋白检测。因此，工作电极上修饰氧化石墨烯的量对其性能是至关重要的。
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