本发明主要涉及检测试剂盒。具体而言，本发明涉及可用于检测人肠道病毒71型感染的试剂盒。
背景技术：
肠道病毒ev71型感染是由人肠道病毒71型(ev71)引起的疾病，临床上主要表现为手足口病，手足口病多在婴幼儿中爆发流行，部分ev71感染患儿表现为疱疹性咽峡炎，重症患者出现病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿、肺出血等。引起手足口病的病原，目前，最常见的是柯萨奇病毒a6和肠道病毒71型;由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高，重症病例病死率可达10%-25%，因此病原学诊断意义重大。
肠道病毒ev71的临床诊断主要依据三个方面:一是临床表现，二是血清学证据，三是病原学证据。由于肠道病毒ev71型感染临床表现多，因此肠道病毒ev71的血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。ev71感染产生免疫保护，感染后可检出igm和igg抗体。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供新的可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法。
本发明人令人惊奇地发现，当以是否seqidno：1~6所示的多肽全部对受试者来源的血液样本中的igm有响应作为判定受试者是否已被人肠道病毒71型感染的指标的情况下，可以以92%以上的灵敏度和5%以下的假阳性率诊断人肠道病毒71型感染。
具体的，本发明提供了：
1.一种检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述固体载体上的seqidno：1~6所示的多肽。
2.根据项1所述的检测试剂盒，其中，所述seqidno：1~6所示的多肽独立地连接于同一固体载体上。
3.根据项1所述的检测试剂盒，其中，所述固体载体是sj改性硅胶。
4.根据项1所述的检测试剂盒，其用于诊断人肠道病毒71型感染。
5.一种诊断受试者是否为人肠道病毒71型感染的方法，该方法包括：
使用项1~4中任一项所述的检测试剂盒检测所述seqidno：1~6所示的多肽对受试者来源的血液样本中的igm是否有响应；其中，
当所述seqidno：1~6所示的多肽全部对受试者来源的血液样本中的igm有响应时，判定该受试者为人肠道病毒71型感染；否则，判定该受试者为非人肠道病毒71型感染。
6.根据项5所述的方法，其中，所述血液样本为全血、血浆或血清。
7.根据项5所述的方法，其中，所述受试者为具有手足口病临床症状的受试者。
本发明涉及的多肽为：
seqidno：1所示的多肽序列为gkgelcavfradpgrngpwq；
seqidno：2所示的多肽序列为edthppykqtqpgadgfelq；
seqidno：3所示的多肽序列为sldfalsllrrnirqvqtdq；
seqidno：4所示的多肽序列为nkepavlhsrdprlevdfeq；
seqidno：5所示的多肽序列为ghftmlgvrdplavlprhsq；
seqidno：6所示的多肽序列为lireysnrsaigntiealfq。
所述多肽可以适宜采用(1)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子wo2004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出：具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
特别是多肽的化学合成已经实现了商业化，可以通过委托专业的多肽合成公司来合成所述多肽。
本发明涉及的试剂盒为：
一种检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述固体载体上的seqidno：1~6所示的多肽。
经实验证实，本发明的试剂盒能够以92%以上的灵敏度和5%以下的假阳性率诊断人肠道病毒71型感染。本说明书中，灵敏度是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。假阳性率是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域检测人肠道病毒71型感染的“金标准”方法是核酸检测法、即pcr法。本说明书中，“诊断”可以是确诊，也可以是为确诊提供参考信息。
在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
构成固体载体的材料包括但不限于：硅胶（聚二甲基硅氧烷，pdms）、纤维素、特氟隆tm、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组合等。
固体载体的形状包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
磁珠可以具有约25nm~约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约50nm~约10μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。由sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24μm~约165μm范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24μm~约44μm范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从polysciences，warrington，pa或spherotech，liberville，il购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
二氧化硅(sio2)-处理或二氧化硅(sio2)基的固体载体的例子包括可从polysciences，warrington，pa购买的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如dna)。或者，还可以使用可从dynalbiotech购买的m-280等。
具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出polysciences，warrington，pa销售的珠子(名称：biomag(注册商标)羧基)、或者bangslaboratory，inc.，fishers，in的名称为mc02n/2928的珠子。或者，可以使用dynalbiotech销售的m-270等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述固体载体是sj改性硅胶，其是苏州偲聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(ipdms薄膜，参见中国专利cn101265329a)。这种材料是以生物学研究常用的pdms为基础，在其中加入特定的引发剂成分（使该材料可通过表面引发聚合反应（sip）实现表面功能化修饰），再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate),poegma)表面修饰获得的。sj改性硅胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(nonspecificproteinadsorption，npa)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对0”水平（接近或低于仪器的检测极限），不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州偲聚公司已经成功地将sj改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列elisa试剂盒，实现了高通量和高灵敏的检测，证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时，这种材料还具有表面性质可调的特性，可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
本发明中，多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如，对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)carbodiimide,edc]和n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide
,nhs)的反应将改性硅胶表面高分子链上的羧基（-cooh）基团改为活化基团，该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基（-nh2）反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面。
对于点样时使用的点样液中多肽的浓度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1μg~1000μg/ml，更优选10μg~500μg/ml。此外，对于多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1~100点/10mm2，更优选5~50点/10mm2。
在本说明书中，“独立的”是指：该多肽在所述固体载体上形成一个点，该点中不包含对检测有影响的量的其他多肽，优选仅包含该多肽。
本发明的试剂盒中的固体载体可以是一个，也可以是多个，例如为两个以上，但优选为1个。
该试剂盒还可以包括：
1.配好的血清稀释液或血清稀释液组分溶液：血清稀释液，例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液（产品编号070021-s2）、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液（产品编号bwj010103）等。该血清稀释液用来稀释血清，试剂盒检测的血清要稀释适当倍数，例如2~200倍，优选10~100倍。
该试剂盒还可以包括：
2.浓缩洗液：固体载体表面孵育血清及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1%的吐温20水溶液，使用时需稀释2~40倍、优选5~20倍。
该试剂盒还可以包括：
3.酶标二抗溶液：人肠道病毒71型感染者血清中的igm与固体载体（例如sj改性硅胶）上的多肽结合，酶标二抗可与igm结合，而酶标二抗上的标记物可与显色底物液反应，从而产生肉眼可见的有色沉淀。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人igm。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制，可以是例如1ng~1000ng/ml。
该试剂盒还可以包括：
4.化学显色底物液（tmb，tetramethylbenzidine，四甲基联苯胺）：化学显色底物tmb可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物酶反应，沉淀产生肉眼可见的蓝紫色斑点信号。
5.一个或两个以上的反应腔体。
例如可以是一个或者两个以上的生物孵育反应器，根据需求可以采用例如双面的生物孵育反应器，参见中国专利zl201120177686.3或者zl201110142518.5；或者单面的生物孵育反应器，参见中国专利zl201220430886.x。
该试剂盒还可以包括：
6.其他用于检测人肠道病毒71型感染的检测分子（例如多肽、蛋白质、核酸等）。
该试剂盒还可以包括：
7.使用说明书。
该试剂盒还可以包括：
8．连接于所述一个或多个固体载体、或其他独立的固体载体上的阳性质控点（可采用例如是人igm作为阳性质控点）和/或阴性质控点（例如磷酸缓冲液，简称pb）。
在另一个方面中，本发明提供一种诊断受试者是否为人肠道病毒71型感染的方法（本发明的诊断方法），该方法包括：
使用上述本发明的检测试剂盒检测所述seqidno：1~6所示的多肽对受试者来源的血液样本中的igm是否有响应；其中，
当所述seqidno：1~6所示的多肽全部对受试者来源的血液样本中的igm有响应时(判据1)，判定该受试者为人肠道病毒71型感染；否则，判定该受试者为非人肠道病毒71型感染。
在本说明书中，“响应”是指：多肽位点显示比阴性对照点强的蓝紫色信号。
本说明书中，对本发明的试剂盒的阳性反应是指：受试者来源的血液样本满足上述判据1；否则为阴性反应。
所述血液样本可以为全血、血浆或血清。
在一个优选的实施方式中，所述受试者可以为具有手足口病临床症状的受试者。在本发明中，手足口病临床症状具体表现为发热和手、足、口腔等部位有皮疹或疱疹。
在本发明的完成过程中，得到了合作单位深圳市儿童医院、苏州偲聚生物材料有限公司的大力支持，在此表示诚挚感谢。
具体实施方式
实施例1
1）.多肽的制备与确认
实施例中使用的多肽由吉尔生化（上海）有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
seqidno：1gkgelcavfradpgrngpwq。
seqidno：2edthppykqtqpgadgfelq。
seqidno：3sldfalsllrrnirqvqtdq。
seqidno：4nkepavlhsrdprlevdfeq。
seqidno：5ghftmlgvrdplavlprhsq。
seqidno：6lireysnrsaigntiealfq。
2）.试剂盒的制备
检测芯片是以sj改性硅胶（ipdms薄膜）为固体支撑材料，在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。sj改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂，并通过热交联（硅氢键键合）固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到一种新的材料即sj改性硅胶。其制作过程参见国际专利公开wo2014/044184。
制好的sj改性硅胶薄膜可保存在4℃冰箱中。
采用晶芯®personalarrayertm16个人点样仪在改性硅胶上制备多肽微阵列(即检测芯片)，过程为：
1）预处理
将sj改性硅胶薄片（15×15mm2）浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗3次，用氮气吹干，马上用于点样。
2）点样
将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条件为室温（25℃），湿度设定为50%。将seqidno：1~6所示的多肽在sj改性硅胶薄片上点成微阵列，每个多肽点样一个点，另外点样一个人igm点作为阳性质控点以及一个pb点作为阴性质控点。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nl，样点半径为200μm。
3）化学固定
刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱（26℃,60%湿度）中固定至少6h。化学固定过程参见国际专利公开wo2014/044184。
首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲液开始蒸发，捕获多肽分子与sj改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性硅胶表面的ploy(oegma)高分子的末端-cooh与多肽分子的-—nh2形成稳定共价键，进而将有化学活性的多肽分子固定在sj改性硅胶表面。
4）装配
固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将sj改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上，盖上反应腔体。生物孵育反应器可以根据需求采用双面生物孵育反应器，即，一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成，或者单面生物孵育反应器，即，一个反应器由一个反应柱和一个反应腔体组成。
5）保存
装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4℃的冰箱中，备用。
3）.用试剂盒进行检测
检验步骤：
1)平衡试剂温度：将所有试剂平衡至室温。
2)洗液的配制：将浓缩洗液用纯化水或蒸馏水按1:9稀释，例如：450ml纯化水或蒸馏水中加入50ml浓缩洗液，充分混匀。未使用完的洗液放在2~8℃保存,可保存3个月。
3)样品的稀释：将待测样品用血清稀释液按1:100稀释（如：2μl血清加入到198μl血清稀释液，充分混匀）。一次样品检测需要稀释后的样品200μl。
4)润湿芯片：取出检测所需的生物芯片孵育反应器。加入1ml洗液，浸润芯片表面3分钟。弃去浸泡芯片的洗液。
5)加样：在本实施例中，以单面生物孵育反应器加样，使用移液枪将稀释好的待测样品通过加液通气孔（两个中任意一个）加入单面生物孵育反应器中，每个单面生物孵育反应器加200μl，用密封贴封闭加液通气孔（两个）。
6)样品孵育：将加完样的单面生物孵育反应器置于水平摇床上150rpm，室温孵育30分钟。
7)清洗：将反应柱从单面生物孵育反应器的反应腔体中取出，弃去反应器内液体，反复冲洗反应柱顶部芯片表面和反应腔体内部3次（每次约用12ml洗液，冲洗1-2分钟）。
8)酶标抗体孵育：将反应柱与反应腔体重新组合，卡紧。揭去密封贴，每个单面生物孵育反应器加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人igm溶液200μl。重新用密封贴封闭加液通气孔。置于摇床上150rpm，室温孵育30分钟。
9)再清洗：弃去反应腔体，用洗液仔细清洗芯片表面3次。
10)加入显色底物液：每个芯片表面分别加入100μl显色底物液，使显色液能均匀的铺于芯片表面。
11)结果判定：对于每一份血清，通过肉眼观察，统计试剂盒中的每一条多肽是否有响应（即肉眼可见强于阴性对照点的蓝紫色信号），并根据上述“诊断方法”部分中所描述的判据1进行判定。
对收集到的临床血清588份，采用上述试剂盒的检测结果与采用传统的金标准法-核酸检测法（采用takara的荧光定量pcr检测试剂盒）的检测结果进行比较，结果如表1所示。上述临床血清588份的提供者均具有手足口病的临床症状。
表1实施例的试剂盒与takara的荧光定量pcr检测试剂盒的比较
以上结果表明，本发明用于检测人血清中肠道病毒71型抗体（igm）具有良好的准确率，灵敏度和特异性，适用于肠道病毒71型的病原学实验室辅助诊断，且操作简单，适合各级医疗和疾控部门使用。
以上，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
sequencelisting
<110>复旦大学；上海市公共卫生临床中心
<120>可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒
<160>6
<170>patentinversion3.2
<210>1
<211>20
<212>氨基酸
<213>人工序列
<400>1
gkgelcavfradpgrngpwq20
<210>2
<211>20
<212>氨基酸
<213>人工序列
<400>2
edthppykqtqpgadgfelq20
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<211>20
<212>氨基酸
<213>人工序列
<400>3
sldfalsllrrnirqvqtdq20
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>20
<212>氨基酸
<213>人工序列
<400>6
lireysnrsaigntiealfq20