新型γδT细胞在制备评估AML疗效试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，特别涉及新型γδt细胞亚群在制备预测aml疗效及预后试剂盒中的应用。

背景技术：

急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia，aml)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有高度异质性，白血病细胞由于失去分化成熟的能力而停滞于细胞发育的不同阶段，并在骨髓及其他造血组织中大量聚积，使正常造血发生障碍，是成人中最为常见的白血病类型。目前对于aml的治疗主要包括诱导治疗和巩固治疗，近30年来，虽然aml的治疗取得了一定的疗效，对于某些伴有不良染色体或基因异常改变的aml患者由于无法彻底清除体内的白血病细胞，仍面临着缓解后复发或耐药。目前对于难治复发的aml患者来说，尚无高效的治疗方法，因此新的治疗策略有待于进一步提出，以清除患者微小残留病灶，延长患者生命，提高其生存质量。

目前的研究显示，t细胞过继性免疫治疗针对aml患者展现出良好的应用前景。人类外周血t细胞根据所含肽链的不同，可分为αβt细胞和γδt细胞两个亚群。γδt细胞仅占人类外周血t细胞的1～10％，具有非主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)限制性识别抗原的特性。近年来越来越多的研究表明γδt细胞具有多种多样的生物学功能，在宿主对外抗感染，抗肿瘤免疫，对内进行免疫监视、免疫防御、移植免疫及自身免疫病等多方面都发挥着重要作用。随着对γδt细胞研究的逐步深入，人们发现其不仅具有激活免疫反应的强大作用，在特定的条件下，同时也具有免疫调节功能。传统的调节性t细胞(regulatorytcells，treg)是一类具有免疫抑制性及免疫无能性的t细胞，在维持自身稳态方面有重要作用；研究表明在某些疾病状态下，其细胞数量的降低或增高可能参与了疾病的发生发展。调节性γδt细胞(regulatoryγδtcells，γδtreg)是近年来新发现的γδt细胞中的一种特殊亚群，表达特异性胞内转录因子叉头翼状螺旋家族转录抑制物p3(forkheadwinged-helixfamilytranscriptionalrepressor，foxp3)。本发明的发明人在前期的研究中证实(专利申请号为cn201610752852.5的专利文献)，aml初发患者外周血γδt细胞的t细胞受体(tcellreceptor，tcr)谱系分布及克隆增殖情况均发生了不同程度的改变，其不同亚群所执行的可能不尽相同。目前尚没有与γδt细胞亚群相关的有效预测aml患者临床疗效及状态评价的实验室指标；业界也没有对aml患者中pd-1信号通路途径是否参与调控γδtreg细胞进行探讨研究。本发明正是基于目前存在的技术问题而提出的新的解决方案。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供新型γδt细胞亚群在制备用于预测aml疗效及预后评估试剂盒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种预测aml疗效及预后评估的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种用于预测aml疗效及预后评估的γδt细胞亚群的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

新型γδt细胞亚群在制备用于预测aml疗效及预后评估试剂盒中的应用，是基于本发明的发明人首次发现aml患者外周血中新型的γδt细胞亚群表达情况与aml患者的疗效和预后相关。

所述的γδt细胞亚群包括foxp3+γδt细胞、pd-1+γδt细胞和pd1+foxp3+γδt细胞中的一种或至少两种。

当所述的pd1+foxp3+γδt细胞表达比例高时，表明aml患者临床疗效差的可能性较大。

所述的pd1+foxp3+γδt细胞表达比例高具体指：

①当pd1+foxp3+γδt细胞在总γδt细胞中所占比例的中位数为1.36％，aml患病的可能性较大；

②当pd1+foxp3+γδt细胞在总γδt细胞中所占比例的中位数为0.32％；aml缓解的可能性较大；

③当pd1+foxp3+γδt细胞在总γδt细胞中所占比例的中位数为0.1％时，为非aml疾病状态的可能性较大。

所述的aml患病包括aml初发、aml预后不良或aml复发。

一种预测aml疗效及预后评估的试剂盒，包括如下不同的荧光标记的单克隆抗体：抗cd45抗体、抗cd3抗体、抗tcrγδ抗体、抗pd-1抗体、所述的抗pd-1抗体的同型对照抗体和抗foxp3抗体。

所述的抗cd45抗体的荧光标记优选为v450。

所述的抗cd3抗体的荧光标记优选为alexafluor700。

所述的抗tcrγδ抗体的荧光标记优选为pe/cy7。

所述的抗pd-1抗体或所述的抗pd-1抗体的同型对照抗体的荧光标记优选为pe。

所述的抗foxp3抗体的荧光标记优选为alexafluor647。

所述的试剂盒还包括所述的单克隆抗体各自对应的同型对照抗体。

所述的试剂盒还包括用于细胞染色破膜的试剂、用于分离外周血单个核细胞的试剂和磷酸盐缓冲溶液(pbs)中的一种或至少两种。

所述用于细胞染色破膜的试剂包括细胞染色缓冲液、固定/破膜缓冲液、破膜缓冲液中的一种或至少两种。

所述的固定/破膜缓冲液优选为foxp3固定/破膜缓冲液；所述的破膜缓冲液优选为foxp3破膜缓冲液。

所述的用于分离外周血单个核细胞的试剂优选为淋巴细胞分离液(ficoll)。

一种用于预测aml疗效及预后评估的γδt细胞亚群的检测方法，包括如下步骤：

(1)处理待测外周血样本，形成单细胞悬液；具体来说，将待测外周血依据常规方法处理，分离得到淋巴细胞悬液；

(2)在步骤(1)得到的单细胞悬液中加入标记不同荧光的单克隆抗体：抗cd45抗体、抗cd3抗体、抗tcrγδ抗体、抗pd-1抗体、所述的抗pd-1抗体的同型对照抗体，轻轻混匀后避光孵育；

(3)洗涤细胞后加入固定/破膜缓冲液，避光孵育，再次洗涤细胞，充分混匀后，离心去上清；

(4)洗涤细胞，加入破膜缓冲液重悬细胞避光孵育；

(5)离心去上清，加入荧光标记后的抗foxp3抗体避光孵育；

(6)洗涤细胞后加入pbs重悬细胞，流式细胞仪上机检测，获得荧光标记后的所述的γδt细胞亚群的数据；

(7)结果分析：对所述的γδt细胞亚群的表达比例进行统计学分析，当检测到pd1+foxp3+γδt细胞表达比例高时，表明aml患者的预后不良可能性大。

步骤(1)中所述的淋巴细胞悬液的终浓度优选为1x10⁶/100μl。

步骤(2)中所述的抗cd45抗体的加入比例优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比3～6μl所述的抗cd45抗体；进一步优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比5μl所述的抗cd45抗体。

步骤(2)中所述的抗cd3抗体的加入比例优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比3～6μl所述的抗cd3抗体；进一步优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比5μl所述的抗cd3抗体。

步骤(2)中所述的抗tcrγδ抗体的加入比例优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比3～6μl所述的抗tcrγδ抗体；进一步优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比5μl所述的抗tcrγδ抗体。

步骤(2)中所述的抗pd-1抗体或所述的抗pd-1抗体的同型对照抗体的加入比例优选为分别为每100μl的淋巴细胞悬液配比3～6μl所述的抗pd-1抗体或所述的抗pd-1抗体的同型对照抗体；进一步优选为每100μl的淋巴细胞悬液配比5μl所述的抗pd-1抗体或所述的抗pd-1抗体的同型对照抗体。

步骤(2)中所述的避光孵育的具体操作为在4℃避光孵育30分钟。

步骤(3)中所述的避光孵育的具体操作为在4℃避光孵育20分钟。

步骤(3)中所述的洗涤优选为用细胞染色缓冲液洗涤。

步骤(4)中所述的避光孵育的具体操作为在4℃避光孵育15分钟。

步骤(4)中所述的洗涤优选为用破膜缓冲液洗涤。

步骤(5)中所述的避光孵育的具体操作为在4℃避光孵育30分钟。

步骤(7)中所述的统计学分析优选为进行pearson相关性分析。

步骤(7)中所述的pd1+foxp3+γδt细胞表达比例高具体指：

①当pd1+foxp3+γδt细胞在总γδt细胞中所占比例的中位数为1.36％，aml患病的可能性较大；

②当pd1+foxp3+γδt细胞在总γδt细胞中所占比例的中位数为0.32％；aml缓解的可能性较大；

③当pd1+foxp3+γδt细胞在总γδt细胞中所占比例的中位数为0.1％时，为非aml疾病状态的可能性较大。

所述的方法和应用为非诊断用途。

虽然目前已有程序性死亡受体1(programmeddeath-1，pd-1)与程序性死亡受体-1配体-1(programmeddeath-1ligand，pd-l1)信号通路途径可能促进treg细胞的功能和分化的报道。但本发明的发明人首次对aml患者中pd-1信号通路途径是否参与调控γδtreg细胞这一技术空白进行了研究探讨，以期提供更为有效的评价aml患者临床疗效及状态的实验室指标。因此本发明结合临床资料，创新地通过流式细胞术详细研究aml状态下γδt细胞功能亚群及分布，从而高效地获得γδt细胞及其亚群，更好地对白血病患者进行治疗，可为aml过继性免疫治疗提供更多的科学理论。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明人首次发现在成人外周血存在着一种新型亚群pd1+foxp3+γδt细胞，其表达比例的高低情况与aml患者的疾病状态及转归有一定的相关性；可作为aml患者的预后指标之一，对于aml患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。

2.本发明提供了pd1+foxp3+γδt细胞的检测方法，通过该检测方法可将该新型γδt细胞亚群表征并定量统计，在预测aml患者临床疗效和预后评价方面具有广阔的前景，可为aml个体化治疗提供更多的基础研究资料。

附图说明

图1是aml初发患者与健康对照组外周血3类γδt细胞功能亚群表达比例流式细胞术结果分析图。

图2是健康对照组与aml初发患者的外周血3类γδt细胞功能亚群表达情况分析图。

图3是健康对照组外周血3类γδt细胞功能亚群之间的表达比例的相关性分析结果图。

图4是aml初发患者外周血3类γδt细胞功能亚群之间的表达比例的相关性分析结果图。

图5是aml初发组、复发组和缓解组γδt细胞功能亚群表达比例的分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂信息具体如下：

v450标记小鼠抗人cd45(h130，购自bdpharmingen)；

alexafluor700标记小鼠抗人cd3(ucht1，购自biolegend)；

pe/cy7标记小鼠抗人tcrγδ(b1，购自biolegend)；

pe标记小鼠抗人pd-1(eh12.2h7，购自biolegend)；

alexafluor647标记小鼠抗人foxp3(206d，购自biolegend)；

细胞染色缓冲液(cellstainingbuffer，购自biolegend)；

foxp3固定/破膜缓冲液(foxp3fix/permbuffer，购自biolegend)；

foxp3破膜缓冲液(foxp3permbuffer，购自biolegend)。

实施例1

(1)在与患者签署知情同意书的前提下采血，所有标本取自于清晨空腹静脉血肝素抗凝。收集aml初发14例，复发患者5例，及缓解患者4例外周血样本。同时收集健康成人样本15例，该部分研究方案已经获得本单位伦理委员会通过。同时收集aml患者临床疗效等临床资料(如表1所示)。

(2)分离外周血单个核细胞。取淋巴细胞分离液(ficoll，密度1.077)4ml加入15ml离心管内，将稀释后的抗凝外周血标本混悬液平铺于分离液之上，以水平离心机于1500rpm离心15分钟。吸取中间单个核层转移至另一15ml离心管中，再加入适量1×pbs，轻轻吹打，以1000rpm离心洗涤10分钟，弃上清，加入1×pbs液至2ml，混匀后计数，并用同样的方法洗涤两次，按1x10⁶/100μl调整细胞浓度备用，得到细胞悬液。

(3)流式细胞术检测γδt细胞功能亚群的表达情况

3.1用每例样本需准备2个流式管，1个设为待测管，1管设为同型管，每管加入100μl步骤(2)制得的细胞悬液。

3.2在待测管及同型管分别加入相应的表面分子荧光抗体各5μl，其中包括小鼠抗人v450-cd45、alexafluor700-cd3、pe/cy7-tcrγδ、fitc-tcrvδ1、percp-tcrvδ2；待测管加入pe-pd-15μl，同型管加入对应的pe-pd-1同型对照抗体5μl，轻轻混匀后，4℃避光孵育30分钟。

3.3加入cellstainingbuffer以300g的转速洗涤细胞5分钟。

3.4向每个流式管加入1mlfoxp3fix/permbuffer充分混匀后于4℃避光孵育20分钟用cellstainingbuffer以300g的转速洗涤细胞5分钟后去掉上清。

3.5用1mlfoxp3permbuffer再次洗涤细胞。用1mlfoxp3permbuffer重悬细胞于4℃避光孵育15分钟。

3.6离心后去掉上清，加入alexafluor647-foxp3抗体于4℃避光孵育30分钟，洗涤细胞后，用500μlpbs重悬细胞后使用流式分析仪(bdverse,usa)分析获取数据，所得数据用flowjosoftware分析。

(4)将γδt细胞功能亚群的表达情况结合aml患者临床资料，与患者临床疗效进行分析(表1)，发现aml患者外周血中存在着一类pd1+foxp3+γδt细胞(图1和图2)。采用pearson分析各组γδt细胞中pd-1⁺亚群、foxp3⁺亚群和pd1⁺foxp3⁺亚群表达比例的相关性，结果提示在健康对照组γδt细胞中pd1⁺γδt亚群、foxp3⁺γδt亚群和pd1⁺foxp3⁺γδt亚群表达均无显著相关性(如图3)，而在aml初发患者组的pd1⁺γδt亚群与pd1⁺foxp3⁺γδt亚群，foxp3⁺γδt亚群与pd1⁺foxp3⁺γδt亚群的表达比例均呈现正相关性，提示患者foxp3⁺γδt亚群比例明显增加，且与pd1⁺γδt亚群和pd1⁺foxp3⁺γδt亚群的高比例相一致，反映患者γδt细胞呈现免疫抑制状态(如图4)；aml初发及复发患者中foxp3+γδt细胞、pd1+γδt细胞和pd1+foxp3+γδt细胞表达比例明显增加(图5)。pd1+foxp3+γδt细胞在aml各状态下的比例呈复发组>初发组>缓解组。由以上结果可知，复发组中pd1+γδt细胞和pd1+foxp3+γδt细胞表达明显增加，可能与aml患者的难治复发相关，而本发明中新型pd1+foxp3+γδt细胞的发现对于难治复发患者的个体化治疗提供更多的分析评估及基础研究资料。上述实验结果表明通过检测γδt细胞功能亚群在预测aml临床疗效及患者状态的评估中具有重要意义。

表1aml患者临床资料

注：f表示女性，m表示男性。

从上述测得的表达比例虽然不能直接得出将来诊断结果和健康状况，但其作为中间结果，可以作为患者临床治疗方案制定的参考信息之一。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。