本发明涉及双肿瘤标志物的定量检测领域，更具体的说是基于枝状二氧化钛纳米棒-钛酸锶异质结同时特异性检测两种肿瘤标志物的光致电化学免疫传感器的构建。本发明还涉及无机纳米复合材料的合成领域。
背景技术：
肿瘤标志物是肿瘤细胞通过基因表达而合成、分泌，或是机体因对肿瘤产生反应而异常产生的一类物质，在肿瘤早期诊断中有重要作用。及时检测肿瘤标志物的含量对于临床肿瘤筛查和早期诊断有重要意义，因此需要构建高灵敏度的免疫传感器用于检测肿瘤标志物。目前已报道的免疫传感器大多数用于检测单一肿瘤标志物，只有极少数的免疫传感器用于检测双肿瘤标志物。与检测单一肿瘤标志物相比，同时检测双肿瘤标志物策略具有检测量大、成本低、分析速度快等优点。并且在临床诊断中，由于单一肿瘤标志物对于肿瘤细胞异常表现的敏感性或特异性偏低，导致检测灵敏度低，同时检测双肿瘤标志物则可以显著提高检测的灵敏度、特异性和准确度。
现如今，电化学法、化学发光法、电化学发光法和光致电化学（pec）法等方法已用于肿瘤标志物的检测。其中pec法由于激发光源和检测信号完全分离，在检测过程中背景信号被极大的削弱，使得传感器具有背景信号低、响应速度快、灵敏度高等优势。目前，已经构建的用于检测双肿瘤标志物的pec免疫传感器中，大部分的工作都是通过将工作区域进行空间分离，从而区分不同肿瘤标志物产生的信号，导致制作步骤繁琐、操作复杂、检测过程耗时等问题。鉴于这些情况，迫切需要设计一种操作简单、灵敏度高、在单工作区同时检测双肿瘤标志物的pec免疫传感器。
众所周知，pec免疫传感器的灵敏度与光敏材料的光电转换效率密切相关。枝状二氧化钛纳米棒(b-tio2nrs)作为本发明的光敏材料，具有大比表面积，良好化学稳定性和优良光电效应等优势。但b-tio2nrs的光生电子-空穴对复合速率过快，导致光电转换效率较差。为了解决这一问题，与金属离子掺杂、与其他半导体复合等方法已经用于提高b-tio2nrs的光电转换效率。其中，钛酸锶（srtio3）作为n型半导体材料，其导带位置比b-tio2nrs导带位置低，使得srtio3可与b-tio2nrs配对产生能带电势差，且由于srtio3与b-tio2nrs不同的能带结构会产生耦合作用，因而srtio3与b-tio2nrs复合形成b-tio2nrs-srtio3异质结，可以促进光生载流子的转移和分离，进而抑制电子-空穴对的复合，提高传感器的灵敏度。
技术实现要素：
在本发明中，我们构建了基于高性能b-tio2nrs-srtio3异质结的pec免疫传感器，用于同时检测双肿瘤标志物甲胎蛋白（afp）和糖类抗原153（ca153）。利用水热法制备b-tio2nrs-srtio3电极，有效的促进载流子分离和空穴传输，产生的光电流密度与b-tio2nrs相比有较大增加。在b-tio2nrs-srtio3结构的基础上，利用β-半乳糖苷酶（β-gal）和乙酰胆碱酯酶（ache）作为信号标记物，特异的催化对氨基苯基吡喃半乳糖苷（papg）和乙酰胆碱（atc）水解，原位生成对氨基苯酚（pap）和胆碱（tc），分别产生相应牺牲电子供体，用于区分光电流信号。由于合适的信号差异，该策略可以实现高灵敏度和特异性检测afp和ca153。
本发明通过以下实验方案实现：
（1）制备二氧化钛纳米棒。5~20ml盐酸（12m）加入5~20ml超纯水中，室温搅拌10min，加入0.2~10ml钛酸四正丁酯溶液，继续搅拌30min得到混合溶液；掺杂氟的sno2透明导电玻璃（fto）依次在丙酮、乙醇、超纯水中各清洗10min，干燥后以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150℃烘箱内恒温反应30~300min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，放入真空干燥箱中60℃干燥8h。
（2）制备三维b-tio2nrs。量取0~10ml盐酸加入盛有10~50ml超纯水的烧杯中，室温搅拌10min，加入0~10ml三氯化钛溶液，继续搅拌10min得到混合溶液；将步骤（1）制备的二氧化钛纳米棒以导电面向上的方式放入混合溶液中，用保鲜膜封口烧杯，置于90℃烘箱中反应10~120min，反应完毕后，取出样品，用超纯水彻底冲洗3次，放入真空干燥箱中60℃干燥8h；最后，将样品放入500℃马弗炉中煅烧2h以提高结晶度。
（3）制备b-tio2nrs-srtio3异质结。称取0.05~0.5g钛酸锶加入盛有1~20ml超纯水的烧杯中，室温搅拌30min后，依次加入1~20ml一缩二乙二醇，1~20ml无水乙醇，1~20ml异丙醇，1~20ml氢氧化四丁铵（40wt%）水溶液，继续搅拌30min得到混合溶液并转移至高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将步骤（2）得到的b-tio2nrs以导电面向上的方式放入内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的160℃烘箱内恒温反应30~240min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水和乙醇分别清洗3次，最后将样品放入60℃真空干燥箱中干燥8h。
（4）构建pec免疫传感器。10~40μl0.5mg/ml壳聚糖滴加到b-tio2nrs-srtio3电极表面，室温孵育2h，用1mnaoh和超纯水分别清洗3次，10~40μl戊二醛滴加至电极表面，室温孵育30min，用超纯水彻底清洗3次。0~40µl含0.5mg/mlafpab1与0.5mg/mlca153ab1混合溶液滴加到电极表面，在4℃下孵育16h，用ph7.4pbs彻底冲洗3次，继续滴涂10ml3%的牛血清白蛋白封堵非特异性结合位点，用ph7.4pbs彻底冲洗3次，10~40μl不同浓度afp和ca153混合抗原滴加至电极表面，37℃孵育30min，用ph7.4pbs洗涤3次，滴加10~40µl0.25mg/ml生物素-afpab2，37℃孵育30min，用ph7.4pbs洗涤3次；然后，滴加10~40µl含0.2mg/ml链霉亲和素的0.01mpbs(ph7.4)溶液，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤3次，滴加10~40µl0.5mg/ml生物素-β-gal，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤3次；滴加10~40µl0.25mg/ml生物素-ca153ab2，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤3次，最后，滴加10~40µl0.25mg/ml链霉亲和素-ache，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤液彻底冲洗3次，pec免疫传感器成功构建。
（5）光致电化学免疫检测。pec检测在自制的配备500w氙灯和单色仪的pec系统进行。首先将步骤（4）构建的pec免疫传感器浸入含0.01mmg2+和10mmpapg的0.1mpbs(ph7.4)溶液，室温孵育15min，用pec法测定afp的浓度；超纯水彻底冲洗免疫传感器后，浸入到含2mmatc的0.1mpbs(ph7.4)中，室温孵育10min，用pec法测定ca153的浓度。
本发明的有益效果：
（1）利用水热法制备的b-tio2nrs-srtio3，显著促进光生载流子分离和空穴传输，抑制电子-空穴对的复合，进一步提高传感器的灵敏度。
（2）本发明构建的免疫传感器使用特异性水解酶β-gal和ache作为信号标志物，特异性水解papg和atc分别产生相应牺牲电子供体，用于区分光电流信号，实现了单工作区对afp和ca153特异性检测。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，按照本发明技术方案结合实施例进行实施，给出具体的实施方式：
（1）制备二氧化钛纳米棒。5~20ml盐酸（12m）加入5~20ml超纯水中，室温搅拌10min，加入0.2~10ml钛酸四正丁酯溶液，继续搅拌30min得到混合溶液；掺杂氟的sno2透明导电玻璃（fto）依次在丙酮、乙醇、超纯水中各清洗10min，干燥后以导电面向下的方式放入高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将混合溶液转移至内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的150℃烘箱内恒温反应30~300min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水彻底清洗3次，放入真空干燥箱中60℃干燥8h。
（2）制备三维b-tio2nrs。量取0~10ml盐酸加入盛有10~50ml超纯水的烧杯中，室温搅拌10min，加入0~10ml三氯化钛溶液，继续搅拌10min得到混合溶液；将步骤（1）制备的二氧化钛纳米棒以导电面向上的方式放入混合溶液中，用保鲜膜封口烧杯，置于90℃烘箱中反应10~120min，反应完毕后，取出样品，用超纯水彻底冲洗3次，放入真空干燥箱中60℃干燥8h；最后，将样品放入500℃马弗炉中煅烧2h以提高结晶度。
（3）制备b-tio2nrs-srtio3异质结。称取0.05~0.5g钛酸锶加入盛有1~20ml超纯水的烧杯中，室温搅拌30min后，依次加入1~20ml一缩二乙二醇，1~20ml无水乙醇，1~20ml异丙醇，1~20ml氢氧化四丁铵（40wt%）水溶液，继续搅拌30min得到混合溶液并转移至高压反应釜的聚四氟乙烯内衬中，将步骤（2）得到的b-tio2nrs以导电面向上的方式放入内衬中，封闭拧紧反应釜，于预热的160℃烘箱内恒温反应30~240min；反应完毕后，将高压釜自然冷却至室温，取出样品，用超纯水和乙醇分别清洗3次，最后将样品放入60℃真空干燥箱中干燥8h。
（4）构建pec免疫传感器。10~40μl0.5mg/ml壳聚糖滴加到b-tio2nrs-srtio3电极表面，室温孵育2h，用1mnaoh和超纯水分别清洗3次，10~40μl戊二醛滴加至电极表面，室温孵育30min，用超纯水彻底清洗3次。0~40µl含0.5mg/mlafpab1与0.5mg/mlca153ab1混合溶液滴加到电极表面，在4℃下孵育16h，用ph7.4pbs彻底冲洗3次，继续滴涂10ml3%的牛血清白蛋白封堵非特异性结合位点，用ph7.4pbs彻底冲洗3次，10~40μl不同浓度afp和ca153混合抗原滴加至电极表面，37℃孵育30min，用ph7.4pbs洗涤3次，滴加10~40µl0.25mg/ml生物素-afpab2，37℃孵育30min，用ph7.4pbs洗涤3次；然后，滴加10~40µl含0.2mg/ml链霉亲和素的0.01mpbs(ph7.4)溶液，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤3次，滴加10~40µl0.5mg/ml生物素-β-gal，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤3次；滴加10~40µl0.25mg/ml生物素-ca153ab2，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤3次，最后，滴加10~40µl0.25mg/ml链霉亲和素-ache，37℃孵育60min，用ph7.4pbs洗涤液彻底冲洗3次，pec免疫传感器成功构建。
（5）光致电化学免疫检测。pec检测在自制的配备500w氙灯和单色仪的pec系统进行。首先将步骤（4）构建的pec免疫传感器浸入含0.01mmg2+和10mmpapg的0.1mpbs(ph7.4)溶液，室温孵育15min，用pec法测定afp的浓度；超纯水彻底冲洗免疫传感器后，浸入到含2mmatc的0.1mpbs(ph7.4)中，室温孵育10min，用pec法测定ca153的浓度。