一种食管癌的生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种食管癌的生物标志物及其应用。

背景技术：

食管癌是世界上高死亡率的癌症之一，5年生存率不足20％，在中国，食道癌主要表现为食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,escc)。尽管临床技术的发展提高了部分食管鳞癌患者的生存率，但食管癌的高死亡率主要归因于肿瘤转移。肿瘤转移包括癌细胞的侵袭，血管增生，在特定器官组织扩散和增殖等一系列的过程，是癌症最致命的特征，占癌症死亡相关原因的90％以上。如佩吉特提出的癌细胞转移“种子和土壤”假说，肿瘤细胞的内在特性和宿主的反应是这一过程的决定因素。在广泛的肿瘤类型中存在同一异质性转移潜能的细胞亚群。然而，很少食管癌转移相关基因的信息和功能验证。

已知中胚叶特异性转录子(mesoderm-specifictranscript,mest)在多种生物学过程中具有重要作用，包括作为人类脂肪细胞的抑制剂，通过骨骼肌印迹基来因网络调控肌肉再生等。然而，极少有关于中胚叶特异性转录子在肿瘤中，特别是在食管癌中的研究。

因此，开发食管癌生存预后或早期诊断的生物标志物，阐明食管癌发生和转移的分子机制，将有助于研发有效的治疗方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种食管癌的生物标志物及其应用，所述生物标志物为中胚叶特异性转录子(mesoderm-specifictranscript,mest)，氨基酸序列如seqidno:1所示；该食管癌早期诊断和生存预后的生物标志物能够用于制备食管癌辅助诊断、疗效评估以及转移复发监控的试剂和/或药物，效果显著，特异性好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种食管癌的生物标志物，所述生物标志物为mest(中胚叶特异性转录子)。

发明人在充分研究食管癌的发展转移机制的基础上，通过大量实验筛选食管癌的生物标志物，发现mest的高表达与食管癌的发生与转移高度相关，设计严谨多维的实验探究并验证了mest作为食管癌早期诊断和生存预后的生物标志物的结论，发现了一种食管癌新的生物标志物及其用于制备食管癌辅助诊断、疗效评估以及转移复发监控的试剂和/或药物的新应用。

所述mest的氨基酸序列如seqidno:1所示；

所述seqidno:1所示的氨基酸序列为：

mvrrdrlrrmrewwvqvgllavpllaaylhipppqlspalhswkssgkfftykglrifyqdsvgvvgspeivvllhgfptssydwykiwegltlrfhrvialdflgfgfsdkprphhysifeqasiveallrhlglqnrrinllshdygdivaqellyrykqnrsgrltikslclsnggifpethrplllqkllkdggvlspiltrlmnffvfsrgltpvfgpytrpseselwdmwagirnndgnlvidsllqyinqrkkfrrrwvgalasvtipihfiygpldpvnpypeflelyrktlprstvsilddhishypqledpmgflnaymgfinsf。

第二方面，本发明提供一种检测如第一方面所述生物标志物的方法；

优选地，所述方法为检测样本中的中胚叶特异性转录子蛋白的表达上调。

优选地，所述样本包括器官组织和/或血清样本。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)收集器官组织并制备成组织微阵列，进行预处理；

(2)将步骤(1)预处理后的切片在柠檬酸盐溶液中加热，进行抗原修复；

(3)将步骤(2)修复后的切片过夜孵育特异性的人单克隆抗体，并孵育相应二抗；

(4)将步骤(3)得到的切片孵育生物素过氧化酶后，进行组织化学染色，然后用苏木精复染，分析相关数据。

作为一个具体的实施例，步骤(1)所述的预处理为脱蜡和水化。

作为一个具体的实施例，步骤(2)所述柠檬酸盐溶液的浓度为8-12nm，例如可以是8nm、9nm、10nm、11nm或12nm，优选为10nm。

作为一个具体的实施例，步骤(2)所述柠檬酸盐溶液的ph值为5-7，例如可以是5、6或7，优选为6。

作为一个具体的实施例，步骤(2)所述抗原修复的时间为10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、18min或20min，优选为15min；

作为一个具体的实施例，所述加热的温度为常压下100℃煮沸，维持恒温。

作为一个具体的实施例，步骤(3)所述人单克隆抗体为兔抗人mest特异性单克隆抗体。

作为一个具体的实施例，步骤(4)所述组织化学染色的显色剂为3,3'-二氨基联苯胺。

作为优选技术方案，一种检测如第一方面所述生物标志物的方法，具体步骤如下：

(1)收集器官组织样本并制备成组织微阵列，进行脱蜡和水化处理；

(2)将步骤(1)处理后的切片在8-12nmph5-7的柠檬酸盐溶液中加热煮沸维持10-20min，进行抗原修复；

(3)将步骤(2)修复后的切片过夜孵育兔抗人mest特异性单克隆抗体，并孵育相应二抗；

(4)将步骤(3)得到的样品孵育生物素过氧化酶后，进行组织化学染色，显色剂为3,3'-二氨基联苯胺，然后用苏木精复染，分析相关数据。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

收集血清样本，采用酶联免疫吸附测定法检测血清中的中胚叶特异性转录子的表达是否上调。

在一个具体的实施例中，一种检测如第一方面所述生物标志物的方法，步骤如下：

包被，加入血清样本，加入酶标抗体，显色，终止反应，结果判定。

第三方面，本发明提供一种将第一方面所述生物标志物用于制备食管癌诊断试剂和/或药物的应用。

第四方面，本发明提供一种将第一方面所述生物标志物用于制备食管癌疗效评估试剂和/或药物的应用。

第五方面，本发明提供一种将第一方面所述生物标志物用于制备食管癌转移复发监控试剂和/或药物的应用。

优选地，所述食管癌为早期食管癌、中期食管癌或晚期食管癌中的任意一种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的生物标志物mest在食管癌组织及食管癌转移组织中大量表达，统计分析存在显著差异，能够有效标记食管癌的发生，为食管癌的诊断、疗效评估以及转移复发监控提供有力工具，为阐明食管癌的发生转移机制提供重要支持。

(2)本发明提供的mest的应用为制备食管癌诊断、疗效评估以及转移复发监控的试剂和/或药物，是mest的新应用，为mest的应用和研究开拓了新的思路。

附图说明

图1为本发明对切片的免疫染色结果进行评分的规则图，其中，1代表阴性结果，2代表弱阳性结果，3代表中阳性结果，4代表强阳性结果；

图2为本发明中正常组织与食管癌组织的染色结果及分析图，其中图2(a)为正常组织与食管癌组织的染色结果图，图2(b)为正常组织与食管癌组织的染色结果的pearson卡方检验分析；

图3为本发明中基于组织芯片免疫组织化学数据的kaplan-meier生存分析结果图；

图4为本发明中食管癌组织与食管癌转移组织的染色结果及分析图，其中图4(a)为食管癌组织与食管癌转移组织的染色结果图，图4(b)为食管癌组织与食管癌转移组织的染色结果的pearson卡方检验分析；

图5为本发明中健康对照组血清与食管癌患者血清的mest含量图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

收集样品

收集外科手术切除食管癌标本100例和80例正常组织以及从上海芯超生物技术有限购买的公司40例原发性食管癌转移组织。

组织微阵列

对包含有100例食管癌组织和80例正常组织进行组织微阵列(tma)(biomax,rockvile,md)免疫组织化学法分析mest的表达，以确定mest表达上调与食管癌发生、发展的相关性；并对上海芯超生物技术有限公司购买的40例原发性食管癌转移组织的另一个组织微阵列(tma)进行mest的免疫组化分析，以比较原发病灶和转移病灶的mest的表达差异，进而确定mest表达水平与肿瘤转移的相关性。

免疫组织化学法

将石蜡包埋的tma在二甲苯中脱蜡，在梯度酒精中水化；过氧化氢去除组织内源性酶；10nmph6的柠檬酸盐缓冲液中加热15min进行抗原修复；封闭后，兔抗人mest特异性一抗4℃孵育过夜；相对应的生物素标记二抗孵育；生物素过氧化酶孵育；采用3,3'-二氨基联苯胺(dako，mississauga，加拿大)显色，苏木精复染，芯片扫描，结果分析。

实施例2

收集样本

收集来自暨南大学和汕头大学的100例患者血清及100例健康对照组的血清。

elisa检测

利用酶联免疫吸附剂测定(elisa)检测100例食管癌患者血清和100例健康对照组的mest表达，以确定mest表达上调与食管鳞状细胞癌的相关性。

实施例3结果分析

1、mest表达

为了研究mest在人类肿瘤中的临床意义，采用免疫组织化学方法检测了mest的表达水平，采用组织微阵列法分析了100例食管癌组织和80例正常组织中mest的表达水平，对切片的免疫染色结果进行评分，评分的规则图如图1所示，tma芯片扫描染色强度：分为(1-4)四个等级，1分代表阴性，2分代表弱阳性，3分代表中阳性、4分代表强阳性。两种病理方法对切片的免疫染色程度进行检验和独立评分，分值为1～2的样本被认为是低表达，分值为3～4的样本被认为高表达；正常组织与食管癌组织的染色结果及分析图如图2所示；

由图2(a)和图2(b)可知，大多数肿瘤病例与正常组织相比，mest表现了强的胞质阳性，p＜0.001。

2、mest表达与食管癌临床病理指标之间的关系

根据国际抗癌联盟(uicc)2003年修正版的tnm分期对患者资料进行归类。病人术前均未接受放疗或化疗。

采用免疫组化的方法对各样本进行mest表达的检测，将标本分为mest低表达组和mest高表达组。分析mest蛋白表达与食管癌临床病理指标之间的关系，结果见表1；

表1

由表1可知，mest的高表达与淋巴结转移(p＝0.033，表1)显著相关，与其他因素无显著相关性，其中n1-阶段表示淋巴结转移。

3、mest表达上调与食管癌预后的关系

对上述100例食管癌患者进行术后随访，调查资料可靠，术后随访资料由医生通过患者门诊复查及电话等方式获得，结果如图3所示；

由图3可知，kaplan-meier生存分析表明，mest高表达的肿瘤患者中均显著缩短生存期(中位生存期为10个月)，与mest较低表达的肿瘤患者(中位生存期为28个月)相比(log-rank，p＜0.001)。

4、食管癌原发病灶及淋巴结转移病灶中mest表达差异

对包含有40例食管癌原发性病灶和对应的淋巴结转移病灶的组织微阵列进行mest表达的分析，结果如图4所示；

由图4(a)和图4(b)可知，大多数转移性病灶的mest表达水平明显高于对应的原发性病灶，p＜0.01。

5、原发病灶和转移病灶的mest的表达差异

因为mest是一种分泌性蛋白，本发明也检测了在100例食管癌患者血清和100例健康对照组的mest表达，结果如图5所示；

由图5可知，与健康对照组相比，食管鳞状细胞癌患者的血清中mest显著表达，确定mest表达水平与肿瘤转移具有相关性。

综上所述，本发明提供的mest的高表达与食管癌的发生转移高度相关，能够用于食管癌的诊断、疗效评估以及转移复发监控，其诊断结果可早于临床症状。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>一种食管癌的生物标志物及其应用

<130>2017

<141>2017-11-24

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>335

<212>prt

<213>人工合成()

<400>1

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