消渴灵片和消渴灵胶囊的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及中药制剂检测技术领域，具体是消渴灵片和消渴灵胶囊的指纹图谱检测方法。

背景技术：

消渴灵片和消渴灵胶囊均由地黄、麦冬、五味子、黄芪、牡丹皮、黄连、茯苓、红参、天花粉、枸杞子和石膏等十一味组成，制法为地黄、麦冬、五味子、黄芪和枸杞子等五味加水煎煮2次浓缩成稠膏，与其余六味细粉混合干燥及其它辅料混匀制成颗粒，压制成片或制成胶囊。具有益气养阴，清热泻火，生津止渴之功效。

现行标准主要有《中国药典》2015年版一部及国家食品药品监督管理局标准ybz06282004，标准中采用显微和薄层色谱鉴别仅对茯苓、石膏、黄连、枸杞子等药材进行控制，尚有多味药材缺乏有效的控制指标。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种消渴灵片和消渴灵胶囊的指纹图谱检测方法，该方法采用高效液相指纹图谱检测方法，可以高效地检测出消渴灵片和消渴灵胶囊中牡丹皮、枸杞子、黄芪、地黄和黄连等多种成分的特征峰，以此判断企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为，能够更好控制投料的数量与质量。

本发明所述消渴灵片和消渴灵胶囊的指纹图谱检测方法包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：hichromalltimac18(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相a，0.01mol/l磷酸二氢钾（用磷酸调ph至3）为流动相b，按表1进行梯度洗脱；检测波长为240nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于10000。

表1梯度洗脱表

（2）供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取约3g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50ml，减压浓缩至干，用90%甲醇定容至10ml，摇匀，滤过，即得。

（3）对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芍药苷30μg的溶液，即得。

（4）建立对照指纹图谱。

（5）进行方法学试验，试验包括如下内容：

1）确定色谱峰归属；

2）被测溶液的稳定性试验；

3）仪器精密度试验；

4）重复性试验。

（6）样品测定：按色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录35分钟色谱图，除去前4分钟色谱峰，供试品色谱图与对照指纹图谱基本一致，有相对应的8个特征峰，与芍药苷相对的是s峰。

本发明的有益效果是：

本发明采用高效液相指纹图谱检测方法，可以高效地检测出消渴灵片和消渴灵胶囊中牡丹皮、枸杞子、黄芪、地黄和黄连等多种成分的特征峰，以此判断企业是否存在不投料或少投料、劣药材投料的行为，能够更好控制投料的数量与质量。

附图说明

图1为a公司批号zka1603样品的高效液相对照指纹图谱；

图2为消渴灵片样品和地黄药材色谱图；

图3为消渴灵片样品和枸杞子药材色谱图；

图4为消渴灵片样品和黄芪药材色谱图；

图5为全部厂家样品重叠图。

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

一种消渴灵片和消渴灵胶囊的指纹图谱检测方法包括以下内容：

仪器与试药

安捷伦1260高效液相色谱仪，配dad检测器；ml204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），hei-vap型旋转蒸发仪（德国heidolph公司）。

芍药苷（中国食品药品检定研究院提供，批号：110736-201741，含量95.7%）；

乙腈、磷酸二氢钾试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯；

消渴灵片、消渴灵胶囊样品为2017年国家评价性抽验的样品；

方法学试验所用消渴灵片为a公司，批号：zka1603。

检测方法包括以下步骤：

（1）色谱条件与系统适用性试验：hichromalltimac18(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相a，0.01mol/l磷酸二氢钾（用磷酸调ph至3）为流动相b，按表1进行梯度洗脱；检测波长为240nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于10000。

表1梯度洗脱表

（2）供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取约3g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液50ml，减压浓缩至干，用90%甲醇定容至10ml，摇匀，滤过，即得。

（3）对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芍药苷30μg的溶液，即得。

（4）对照指纹图谱的建立：a公司样品在本次抽样中抽到的批次较多，共有111批，表明其样品市场份额较大；b公司样品所用标准为国家食品药品监督管理局标准ybz06282004，该标准收载了盐酸小檗碱的含量测定，控制指标多于现行药典，并且实验表明上述两家企业样品质量稳定，故对照指纹图谱以上述两家企业的样品生成。见图1。

（5）进行方法学试验，试验包括如下内容：

1）色谱峰归属

将消渴灵片样品分别和地黄药材、枸杞子药材、黄芪药材的色谱图进行对比，见图2～4，经药材确证，各色谱峰归属如表2。

表2消渴灵片各色谱峰归属表

2）被测溶液的稳定性试验：取同一份供试品溶液（a公司zka1603），按色谱条件，每隔一定时间测定一次，共考察24小时，测定了7次，将测得图谱导入国家药典会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以芍药苷峰为参照峰，由软件计算，结果7次测定供试品图谱与对照品指纹图谱的平均相似度为0.990，rsd＝0.49％（n＝7），见表3。试验表明，供试品溶液至少在24小时内稳定。

表3稳定性考察结果

3）仪器精密度试验

取同一份供试品溶液（a公司zka1603），按色谱条件，连续测定6次。将测得图谱导入国家药典会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”以芍药苷峰为参照峰，由软件计算，结果6次测定供试品图谱与对照品指纹图谱的平均相似度为0.989，rsd＝0.20％（n＝6），见表4。试验表明本法的仪器精密度良好。

表4精密度试验结果

4）重复性试验

取同一份供试品溶液（a公司zka1603），按色谱条件平行测定6份，将测得图谱导入国家药典会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以芍药苷峰为参照峰，由软件计算，结果6次测定供试品图谱与对照品指纹图谱的平均相似度为0.991，rsd＝0.46%（n＝6），见表5。试验结果表明，本法的重现性较好。

表5重复性试验结果

（6）样品测定：按色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录35分钟色谱图，除去前4分钟色谱峰，供试品色谱图与对照指纹图谱基本一致，有相对应的8个特征峰，与芍药苷相对的是s峰。测定了不同厂家不同批号111批消渴灵片和两批消渴灵胶囊的指纹图谱，再对全部抽样样品进行汇总，结果见表6～8，各厂家样品重叠图见图4。从测定结果看出，各企业样品的相似度有一定差异，故将样品指纹图谱相似度暂定为应不得低于0.90。

表6各厂家相似度汇总表

表7消渴灵胶囊相似度结果

表8全部抽样样品指纹图谱不合格结果汇总