本发明涉及临床免疫学检测领域，具体涉及一种定量检测血清淀粉样蛋白a的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术：
血清淀粉样蛋白a(serumamyloida，saa)是一种急性时限反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000d。在急性时限反应中，经il-1、il-6和tnf刺激，saa在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍，但半衰期极短，只有50分钟左右。saa与高密度脂蛋白(hdl)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。saa一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白a(aa)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。
与c反应蛋白(crp)类似，saa的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是，saa检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比c反应蛋白更确凿。研究发现，在患炎性关节炎的案例中，saa与疾病活动性的关系最密切。同时检测c反应蛋白和saa能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白a淀粉样变性患者，以将saa水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情。
对于saa的检测，目前使用的方法主要是化学发光法、免疫比浊、胶体金等，但是这些方法都有各自的特点及不足。化学发光方法需要大型仪器，且耗时长久，成本高昂；免疫比浊灵敏度低，准确度差；胶体金法不能定量检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性的saa临床定量检测试纸条。
为实现上述发明目的，本发明提供一种定量检测saa的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括：
硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线使用saa检测抗体，所述质控线使用抗saa捕获抗体的二抗；
制备结合垫，其包括：
含有纳米增强型时间分辨荧光微球的pbs中，加入终浓度为10mg/ml的edc与nhs，离心，沉淀经pbs洗涤后溶解于pbs中；
saa捕获抗体使用抗体洗涤液离心洗涤；
将洗涤后的saa捕获抗体与所述溶解有荧光微球的pbs混合，以使saa捕获抗体与荧光微球偶联；
将偶联后的混合液喷涂到载体；
其中，pbs为ph6-7、浓度0.05mol/l。
作为本发明一实施方式的进一步改进，荧光微球直径为100nm-300nm。
作为本发明一实施方式的进一步改进，saa捕获抗体与荧光微球混合的重量比是1/10-1/20。
作为本发明一实施方式的进一步改进，saa捕获抗体与荧光微球偶联后，经封闭液封闭，然后喷涂到载体，所述封闭液含有质量百分比为0.1-1％的卡泽35及浓度为10-50mmol/ml的甘氨酸。
作为本发明一实施方式的进一步改进，抗体洗涤液为ph7-8的0.05mol/lpb缓冲液。
作为本发明一实施方式的进一步改进，载体为玻璃纤维膜。
作为本发明一实施方式的进一步改进，在抗体与荧光微球混合之后，还包括步骤：将所述saa捕获抗体与荧光微球的混合液的ph值调整至7.2±0.2。
作为本发明一实施方式的进一步改进，每一检测线的saa检测抗体用量为0.5-2mg。
作为本发明一实施方式的进一步改进，每一质控线的抗saa捕获抗体的二抗，用量为0.5-2mg。
为实现上述目的，本发明一实施方式提供一种定量检测saa的时间分辨荧光免疫层析试纸条，由底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，试纸条由上述的方法制得。
与现有技术相比，本发明通过将双抗体夹心法和时间分辨荧光免疫层析技术引入saa的检测中，结合荧光检测仪，实现了saa的定量检测，且灵敏度高，批内、批间差小，为临床使用提供了极大便利。
附图说明
图1是本发明实施例1的标准曲线图；
图2是本发明实施例2的标准曲线图；
图3是实施例1制得的定量检测saa的试纸条与免疫比浊法的对比测试结果相关性分析；
图4是实施例2制得的定量检测saa的试纸条与免疫比浊法的对比测试结果相关性分析。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
本发明提供的试纸条由塑料卡壳、底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水纸组成。样品垫为空白玻璃纤维膜。结合垫上包被有纳米增强型时间分辨荧光微球标记的saa捕获抗体(captureantibody)。nc膜上包被有检测带和质控带，其中，检测带固定有识别不同抗原表位的saa检测抗体(testantibody)，质控带固定有能结合抗saa捕获抗体的二抗。
结合垫为玻璃纤维膜，其上喷涂了连接有抗体的纳米增强型时间分辨荧光微球。
硝酸纤维素膜(nc膜)上包被的检测带和质控带相互平行，并且相互之间保持一定间隔。
纳米增强型时间分辨荧光微球选用直径100nm-300nm的微球。
试纸条装于塑料卡壳内，在湿度小于35％的环境中组装。
本发明的试纸条由如下步骤制得：
nc膜上制备检测线和质控线，检测线为saa检测抗体(testantibody)，质控线为能结合抗saa捕获抗体的二抗；
玻璃纤维膜上喷涂连接有saa捕获抗体(captureantibody)的纳米增强型时间分辨荧光微球，制得结合垫；
将一空白的玻璃纤维膜切割成适宜尺寸的长条，作为样品垫；
底板、nc膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次交错黏贴，切割成相应尺寸，装入塑料卡壳。
其中，nc膜上包被检测线、质控线的方法包括如下步骤：
检测线使用saa检测抗体，用量为每检测线0.5-2mg。抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液选择pbs+(1-10)％海藻糖+(0-5)％nacl。
质控线使用抗saa捕获抗体的二抗，用量为每质控线0.5-2mg。高于此浓度的抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液选择pbs+(1-10)％海藻糖+(0-5)％nacl。
使用定量喷膜仪以0.8-1.5ul/cm的浓度将上述二种抗体分划于nc膜上，保持两线间隔0.5cm以上。
25-60℃烘干1-5小时，干燥保存。
结合垫的制作方法包括如下步骤：
含有纳米增强型时间分辨荧光微球的pbs中加入终浓度为10mg/ml的edc、nhs，室温反应30min-2小时，其中，pbs为ph6-7、浓度0.05mol/l；
15000-25000rpm/min离心10min，去上清，pbs洗涤2遍，溶解于pbs中；
saa捕获抗体使用超滤离心管洗涤3遍，洗涤液为ph7-8的0.05mol/lpb缓冲液；
将洗涤后的捕获抗体与荧光微球混合偶联，控制抗体与荧光微球重量比是1/10-1/20，补充适量的pb缓冲液使ph等于7.2±0.2，混匀；
室温反应1-4小时；离心去上清；
加入封闭液封闭，封闭液含有0.1-1％卡泽35、10-50mmol/ml甘氨酸，反应2小时；
使用荧光微球稀释液稀释到30-120倍，荧光微球稀释液配方：pbs+20％海藻糖或者蔗糖+1-3％吐温20；
捕获抗体-荧光微球混合液以3.0-8.0ul/cm的浓度定量喷涂到玻璃纤维膜；
25-60℃烘干1-4小时，干燥保存。
样品垫为空白玻璃纤维垫，切割成1.7cmx30cm宽度的长条备用。
使用时，将样品与稀释液混合后加入样品垫。稀释液为含有1-3％吐温20的0.8-1％nacl。稀释液有利于减少样本中其它成分对检测的干扰。在毛细作用下，样品液向吸水纸一端泳动，当待测样品中含有saa时，saa与荧光微球上的捕获抗体形成抗原一抗体复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达检测线时与saa检测抗体(testantibody)形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，聚集在检测线t线处。未结合的荧光微球继续前行，到达质控线c时，二抗与荧光微球上的捕获抗体结合，在c线处出现聚集。整个反应在15分钟内完成。进行上机读卡，t线和c线都会产生相应的荧光信号，荧光检测仪会根据定标卡上的信息将实际检测荧光信号值带入预设的标准曲线中计算出saa的含量。
本发明通过应用纳米增强型时间分辨荧光微球，将时间分辨荧光免疫层析技术引入saa的检测中，结合时间分辨荧光免疫检测仪，有效的提高了平台灵敏度，提升对低值荧光信号的检测效果，从而实现了saa的简单、快速、低成本检测，且灵敏度高，批内、批间差小，为临床使用提供了极大便利，为实现床旁检测提供了方法。
实施例1
本实施例的试纸条由如下步骤制得：
nc膜上包被检测线和质控线。
其中，检测线使用saa检测抗体(testantibody)，浓度为0.5mg，高于此浓度的抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液是pbs+1％海藻糖。
质控线使用抗saa捕获抗体的二抗，用量为0.5mg。抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液是pbs+1％海藻糖。
使用定量喷膜仪以1.5ul/cm数量将两者划于nc膜上，保持两线间隔0.5cm以上，距离nc膜边缘0.2mm以上。
25℃烘干5小时，干燥保存。
另一方面，在玻璃纤维膜上喷涂连接有saa捕获抗体(captureantibody)的100nm纳米增强型时间分辨荧光微球以制备结合垫。
具体地，将纳米增强型时间分辨荧光微球加入ph6.0、浓度为0.05mol/l的pbs溶液中，并加入终浓度为10mg/ml的edc、nhs，室温反应30min；
25000rpm/min离心10min，去上清，pbs洗涤2遍，溶解于pbs中；
saa捕获抗体使用超滤离心管洗涤3遍，洗涤液为0.05mol/lpb缓冲液，ph8；
将洗涤后的捕获抗体与荧光微球混合偶联，控制抗体/荧光微球的重量比为1/20，补充适量的pb缓冲液使ph等于7.0，混匀；
室温反应4小时，离心去上清；
加入封闭液封闭，封闭液含0.1％卡泽35、10mmol/ml甘氨酸，反应2小时；
使用荧光微球稀释液稀释到30倍，荧光微球稀释液配方：pbs+20％海藻糖+1％吐温20；
定量(3.0ul/cm)喷涂到玻璃纤维膜上制成结合垫，25℃烘干4小时，干燥保存。
另一方面，将一空白的玻璃纤维膜切割成1.7cmx30cm宽度的长条备用，作为样品垫。
最后，将底板、nc膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次交错黏贴，切割成3.7mm，装入塑料卡壳。
参图1，采用本实施例制得的试纸条绘制标准曲线。
具体的，采用saa的时间分辨荧光免疫层析试纸条，检测不同浓度的saa标准品(取7个不同的浓度，分别为0mg/l、6.25mg/l、12.5mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l，每个浓度做5个平行样)。膜层析反应15分钟后，仪器读取质控线c、检测线t信号，以检测的样品荧光值信号比值t/c为纵坐标，saa标准品浓度为横坐标，建立方程并拟合成标准曲线。
由图1标准曲线可以看出，该标准曲线的相关系数r2大于0.99，线性较好，可以通过该标准曲线对样品中所含saa浓度进行定量分析。
实施例2
本实施例的试纸条由如下步骤制得：
nc膜上包被检测线和质控线。
其中，检测线使用saa检测抗体(testantibody)，浓度为2mg，高于此浓度的抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液是pbs+10％海藻糖+5％nacl。
质控线使用抗saa捕获抗体的二抗，用量为2mg。抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液是pbs+10％海藻糖+5％nacl。
使用定量喷膜仪以0.8ul/cm数量将两者划于nc膜上，保持两线间隔0.5cm以上，距离nc膜边缘0.2mm以上。
60℃烘干1小时，干燥保存。
另一方面，在玻璃纤维膜上喷涂连接有saa捕获抗体(captureantibody)的300nm纳米增强型时间分辨荧光微球以制备结合垫。
具体地，将纳米增强型时间分辨荧光微球加入ph7.0、浓度为0.05mol/l的pbs溶液中，并加入终浓度为10mg/ml的edc、nhs，室温反应30min；
15000rpm/min离心10min，去上清，pbs洗涤2遍，溶解于pbs中；
saa捕获抗体使用超滤离心管洗涤3遍，洗涤液为0.05mol/lpb缓冲液，ph7；
将洗涤后的捕获抗体与荧光微球混合偶联，控制抗体/荧光微球的重量比为1/10，补充适量的pb缓冲液使ph等于7.4，混匀；
室温反应1小时，离心去上清；
加入封闭液封闭，封闭液含1％卡泽35、50mmol/ml甘氨酸，反应2小时；
使用荧光微球稀释液稀释到120倍，荧光微球稀释液配方：pbs+20％蔗糖+3％吐温20；
定量(8.0ul/cm)喷涂到玻璃纤维膜上制成结合垫，60℃烘干1小时，干燥保存。
另一方面，将一空白的玻璃纤维膜切割成1.7cmx30cm宽度的长条备用，作为样品垫。
最后，将底板、nc膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次交错黏贴，切割成3.7mm，装入塑料卡壳。
参图1，采用本实施例制得的试纸条绘制标准曲线。
具体的，采用saa的时间分辨荧光免疫层析试纸条，检测不同浓度的saa标准品(取7个不同的浓度，分别为0mg/l、6.25mg/l、12.5mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l，每个浓度做5个平行样)。膜层析反应15分钟后，仪器读取质控线c、检测线t信号，以检测的样品荧光值信号比值t/c为纵坐标，saa标准品浓度为横坐标，建立方程并拟合成标准曲线。
由图1标准曲线可以看出，该标准曲线的相关系数r2大于0.99，线性较好，可以通过该标准曲线对样品中所含saa浓度进行定量分析。
实施例3
随机抽取30例病人血清样本，用西门子bii散射比浊仪测试数据作为参照值，用本发明试纸条常温下进行测试对应样本的数值，用统计学分析系统相关性。
本发明试纸条的使用方法为：在saa的荧光免疫层析试纸条的加样区加入待测样品，膜层析反应15分钟；开启荧光检测设备，并将检测条及校准卡括入荧光检测设备的括卡口，运行仪器，通过相应的分析软件自动计算出待测样本中的saa浓度。
参图3及图4，采用上述实施例1及实施例2制得的试纸条分别进行对比实验，结果显示，本发明试纸条的检测结果与西门子saa检测结果差异性小，线性相关系数r2分别达到0.9785和0.9835。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。