一种磁性微球及其制备方法以及微生物的检测方法与流程

本发明涉及微生物检测领域，具体而言，涉及一种磁性微球及其制备方法以及微生物的检测方法。

背景技术：

近年来，随着创伤性诊断和治疗技术的大力发展以及广谱抗生素和激素的广泛应用，血流感染的发病率逐年增加。血流感染的死亡率高，发病率高，住院时间长，医疗费用高，危害严重。因此，血流感染的控制受到越来越多的关注。随着各种操作技术的发展和抗菌药物的应用，引起血流感染的病原体不断变化，病原体的耐药性逐渐增加。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(crpa)、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(crab)和其他耐药菌株不断出现。金黄色葡萄球菌，特别是mrsa是引起血流感染的最重要的致病菌之一。在严重的情况下，它可能导致肺炎、感染性心内膜炎、败血症和骨髓炎等致命疾病。随着临床抗菌药物使用的增加，金黄色葡萄球菌的耐药性越来越严重，mrsa的分离率也越来越高。由于临床治疗困难和愈后不良，它引起了全世界的关注。铜绿假单胞菌不仅引起烧伤患者的菌血症，而且是导管相关性尿路感染(uti)和气管插管患者医院感染的主要原因。它对许多抗生素具有天然抗性，因此被认为是多重耐药病原菌。碳青霉烯类被认为是铜绿假单胞菌感染严重病例治疗的第一道防线，尽管如此，在过去几年中，crpa一直在增加。鲍曼不动杆菌引起的感染主要发生在呼吸系统，可引起呼吸机相关性肺炎(vap)、血流感染、皮肤和软组织感染、浸润性导管感染、泌尿生殖系感染、脑膜炎等，并且没有用于预防鲍曼不动杆菌感染的有效的疫苗。因此，临床上预防，治疗和护理感染这些细菌的患者是极其困难的。

合理使用抗菌药物是降低血流感染发生率和提高治愈率的关键。因此，我们需要快速可靠的诊断方法来加速血培养中的细菌鉴定和药敏检测，以便及时提供适当的治疗和有效的抗生素管理干预。目前，致病菌的鉴定和药敏试验仍主要依赖于常规血培养。该方法需要很长时间(3到5天)并且需要大量的手工劳动，缺乏有效的检测技术，并且导致临床传染病被遗漏或延误诊断。近年来，随着生物技术的快速发展，聚合酶链反应(pcr)，基因芯片，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)和新一代测序技术得到了探索和应用。在病原菌的细菌鉴定和药敏试验中作为传统检测方法的补充，但仍存在许多限制其使用的问题。pcr鉴定期间发生的假阴性或假阳性以及免疫测定过程中所需的多步化学试剂都限制了它们的应用，这些技术昂贵，耗时和/或表现出低敏感性。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种磁性微球，该磁性微球为微生物的检测提供良好的基础。

本发明的第二目的在于提供一种所述的磁性微球的制备方法，该方法简便易行，为磁性微球的广泛应用提供良好的基础。

本发明的第三目的在于提供一种微生物的检测方法，通过检测拉曼信号来判断微生物的种类，大大缩短检测时间。

本发明的第四目的在于提供一种微生物检测试剂盒，为微生物的检测提供便利。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种磁性微球，包括微球本体，所述微球本体携带负电荷；

吸附在所述微球本体外表面的携带正电荷的pei。

pei是一种阳离子聚合物，具有大量的氨基化物和良好的亲水性，pei可以在纳米粒子表面粘附或组装，容易实现组装的均一化分布，以实现表面胺化，为微生物的检测提供良好的基础。

进一步地，所述微球本体为磁性fe3o4颗粒。

进一步地，所述fe3o4颗粒的粒径为200±20nm。

进一步地，所述pei的分子量为25±2kda。

本发明还提供了磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

微球本体与pei在溶剂中超声处理50-70min，洗涤，得到所述磁性微球。

进一步地，所述微球本体在溶剂中的浓度为4-6g/l，所述pei在溶剂中的浓度为4-6g/l。

进一步地，所述溶剂为水。

进一步地，所述洗涤采用双蒸水进行。

表面增强拉曼散射(sers)检测具有成本低，易于操作，高灵敏度，快速和无损测试的优点，并且需要最少的样品制备。细菌表面复杂，含有多种生物大分子，如蛋白质，脂类，多糖等。通过常用的分析方法难以进行实时，原位和非破坏性测试。sers光谱的高灵敏度和指纹图谱可以满足快速准确检测病原微生物的要求。早在1989年，霍尔特和棉花首次报道了sers谱的细菌。四年后，magee教授指出，使用整个生物体的指纹谱完全可以检测病原体。此后，已经报道了基于sers检测细菌的新方法，即细菌的指纹，例如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，炭疽芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。虽然有很多关于sers增强底物的报道直接增强纯培养细菌获得目标细菌的sers指纹并进行聚类分析，但临床样品中致病菌快速sers检测的研究仍处于探索阶段。主要困难是临床样品成分复杂，而常见的sers增强底物缺乏选择性，因此实际样品中杂质的信号会严重干扰目标细菌的sers信号。此外，在快速药物敏感性领域很少有报道，临床医生特别关注这一问题。鉴于sers指纹检测病原菌的问题和临床样品中细菌成分的复杂性，该研究计划通过将病原体多重识别系统分为三个步骤来解决这些问题。第一步是检测病原体及其耐药菌株的指纹图谱作为标准光谱。在第二步中，pei修饰的磁性纳米颗粒用于从临床样品中分离细菌，并且将磁性纳米颗粒/细菌复合物在正常血液平板和抗药性培养板上培养过夜以形成单个菌落。在第三步中，从培养基中选择目标单菌落，并与制备的高性能sers增强材料混合，然后加入到硅晶片中。将混合物自然风干后，检测拉曼光谱，并将获得的细菌光谱与我们在第一步中测量的标准光谱进行比较，以确定它是否是相应的致病菌。显然，在药物敏感培养板上生长的菌落只能是相应的耐药细菌。将菌落与sers增强材料(agnps)混合以检测光谱并与标准光谱比较以确定病原体是否具有抗性。sers指纹图谱和药物敏感培养板可以双重确定致病菌及其耐药菌株。

本发明提供的一种微生物的检测方法，包括以下步骤：

上述的磁性微球吸附待检测物，检测拉曼信号，根据拉曼信号的峰值判断待检测物的微生物种类；

所述待检测物为含有携带有负电荷的微生物的样品。

进一步地，所述待检测物为病原体。

进一步地，所述病原体包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中的任一种或多种。

进一步地，所述待检测样品为血液样品。

即本发明提供的磁性微球能有效吸附样品中的微生物，降低其他杂质的干扰。

在实际操作中，样品与磁性微球混合孵育一段时间后，通过在试管外磁性吸附，使得携带有微生物的磁性微球与磁体吸附，这样可去除其他杂质，然后根据需要进行洗涤，进一步去除杂质。

目前，用于检测患者血液样本的临床实验室程序首先是将血培养瓶放入自动血培养仪进行细菌培养。在细菌增殖至仪器的阳性结果(1-2天)后，取出血培养瓶，然后进行平板菌落培养，并在一天后进行细菌鉴定和药物敏感性检测。整个过程大约需要3-5天。

而本发明的方法是在接收血培养瓶时将磁性微球如fe3o4@pei放入血培养瓶中，捕获并富集血液中的细菌，然后将收集的fe3o4@pei@细菌复合物涂在普通平板上和药物敏感板，37℃培养过夜，选择目标致病菌进行拉曼光谱检测，并与之前建立的标准光谱进行比较。通过将光谱与opls-da的化学计量学分析以及普通板和药物敏感板的生长相结合，实现了目标致病菌的鉴定，从而在临床上节省了血液培养瓶中细菌富集的过程，并且整个过程只用了1-2天。

fe3o4@pei纳米粒子具有广谱捕获细菌的能力，因为其表面的正电荷通过静电吸引与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁上的负电荷相互作用，从而获得良好的细菌捕获效率(金黄色葡萄球菌为97.87％，鲍曼不动杆菌为80.57％，铜绿假单胞菌为97.25％)。

进一步地，所述待检测物为病原体。

进一步地，所述病原体包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中的任一种或多种。

进一步地，所述待检测样品为血液样品。

进一步地，所述待检测样品与磁性微球混合，使得磁性微球吸附待检测物。

进一步地，混合后进行孵育，孵育过程中轻轻摇晃，孵育时间为15-20min。

本发明研究了不同孵育时间的fe3o4@pei的细菌捕获率。fe3o4@pei有效捕获金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的孵育程序仅花费15分钟。

进一步地，所述待检测样品中目标菌体含量为10¹cfu/ml-10³cfu/ml；

进一步地，10⁴cfu/ml菌体所需的磁性微球的重量为0.1mg。

本发明还考虑了fe3o4@pei在细菌捕获中的浓度的影响。使用不同体积的fe3o4@pei(2,4,6,8和10μl)按顺序捕获相同的金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌样品(1ml，10⁴cfu·ml^-1)，随着fe3o4@pei的用量增加，细菌的捕获效率增加，获得细菌捕获所需的最佳剂量的fe3o4@pei。

进一步地，磁性微球吸附待检测物与增强信号物质混合后，滴在硅晶片上测量拉曼信号。

拉曼信号峰之间的强度差异主要由核酸、氨基酸和脂质的含量引起。核酸，氨基酸和脂质在生化反应中起关键作用，例如细菌细胞壁的合成过程和结构组成以及细菌的代谢。因此，与细菌抗性相关的变化可以通过细菌的光谱强度和迁移差异来反映。

金黄色葡萄球菌的细胞壁含有丰富的肽聚糖和少量的磷壁酸，并且肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性细菌的网状结构更密集。然而，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌具有细胞壁肽聚糖层，交联度差，脂质含量高，三种菌株之间的细胞壁结构和代谢存在显着差异。因此，脂质(1458cm^-1)，蛋白质(654cm^-1,637cm^-1,958cm^-1)和碳水化合物(731cm^-1,1132cm^-1)的含量也存在显着差异，相应光谱的差异也是明显。在654cm^-1,731cm^-1和1458cm^-1处的sers条带归因于酪氨酸，鸟嘌呤，腺嘌呤，dna和饱和脂肪酸，在mssa中表现出比在mrsa中更高的百分比信号。mrsa具有多种抗性机制，β-内酰胺类抗生素的耐药性主要是由于mrc染色体meca基因的存在，其可编码结合蛋白以合成新的特异性青霉素pbp2a。当β-内酰胺类抗生素作用时，正常的pbps与抗生素结合并失去细胞壁的合成，而pbp2a不受抑制，取代正常的pbp工作，完成细胞壁的合成，使细菌存活并成为耐药菌株。mrsa还可以通过质粒产生β-内酰胺酶，缓慢灭活表现出耐药性的β-乳酰胺抗生素。在mrsa细胞壁的合成过程中，葡萄糖是细菌生长的良好碳源和能量来源，还需要合成蛋白质，从而在光谱中发生相应的光谱强度变化。辅酶a，乙酰辅酶a(724cm^-1)的sers条带在crab中高于csab。乙酰辅酶a是能量代谢的重要中间代谢产物，是细菌能量代谢中的关键物质。它可以合成产品，有利于释放能量，为生命的使用。crab对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要包括β-内酰胺酶的产生，主动外排泵系统的过度表达，青霉素结合蛋白的改变和外膜通透性的降低。这些变化需要大量的能量，也会影响crab细胞壁结构的组成，这是crab和csab之间sers光谱差异的主要原因。由于磷酸二酯，脱氧核糖，腺嘌呤，聚腺嘌呤，色氨酸，腺嘌呤和鸟嘌呤在911cm^-1,1321cm^-1和1351cm^-1处的sers条带在crpa和cspa之间表现出不同的信号。葡萄糖代谢和氨代谢导致氨基酸，糖和其他代谢物的差异，而嘌呤，嘧啶和其他物质的变化与细菌中核酸的扩增有关。crpa的耐药机制复杂，主要包括五种机制，即外膜通透性的变化，药物作用靶的减少或消失，灭活酶或修饰酶的产生，主动外排泵系统和生物膜的形成。这些机制将导致crpa细胞壁蛋白类型的变化，并对细胞壁成分产生显着影响，这是crpa与cspa之间sers光谱差异的主要原因。因此，了解微生物代谢与细菌抗性机制发生之间的关系对于鉴定不同细菌及其抗性细菌至关重要。

opls-da根据y的差异将x的差异分为两部分。第一部分表示与y相关的差异，第二部分表示与y(正交垂直)无关的差异。opls-da可以区分这两个部分之间的差异。它旨在控制和过滤x中直接与y相交或独立于y的变化。这样，opls-da可以更好地区分组间的差异，提高模型的有效性和分析能力。本研究中建立的四种模型的opls-da得分图显示了在同一组中的聚类，并且不同组之间存在明显的分离趋势。我们还通过进行10倍交叉验证来估计模型的分类效率。模型的最小训练和测试集的准确度分别大于98％和96％。这些数据显示了使用opls-da算法建立不同病原体分类模型的可行性。

此外，通过二代测序检测细菌菌株，验证了本发明成功鉴定了细菌。在肉眼观察下，同种细菌敏感菌株和耐药菌株之间的光谱差异不明显。为了提高sers指纹图谱在检测耐药菌株中的准确性，本发明实施了一种基于普通/药敏板单菌落生长和sers指纹图谱比较的方案。在该研究中，磁性分离的细菌在普通和药物敏感的平板上同时培养。敏感细菌会在普通平板上生长菌落，但不会在药物敏感平板上生长，而耐药菌株会在药物敏感平板和普通平板上生长单菌落，然后sers指纹谱结合opls-da统计分析方法用于进一步证实它是否是一种抗生素抗性病原体。通过药物敏感性筛选和sers指纹图谱结合opls-da双重鉴定，可以更准确地检测出病原体的耐药菌株，而不会延长检测时间。

本发明构建了一个多重识别系统，使用pei修饰的磁性纳米粒子快速分离病原体，然后同时在共同/药物敏感板上再培养，并使用sers指纹谱结合opls-da生长的单个菌落，以准确识别病原体及其耐药菌株。整个检测系统不需要复杂的样品预处理，操作简单，无需专业操作，成本相对较低。该检测方案的成功实施将为临床重要致病菌的快速检测和药敏试验提供新的思路和解决方案。

进一步地，使用正交偏最小二乘判别分析区分耐药菌和非耐药菌。

进一步地，耐药菌和非耐药菌的检测还包括在药敏培养板上培养以确认是否耐药。

进一步地，检测拉曼信号前还包括加入增强信号物质的步骤。

进一步地，所述增强信号物质包括纳米银颗粒、胶体金、金核银壳中的任一种。

ag纳米颗粒的溶液在407nm处具有最大吸收和相对窄的半宽，表明颗粒是均匀的并且具有良好的分散性。本发明研究了agnp(银纳米颗粒)在磁性微球吸附待检测物上的分布情况，发现agnp的分布相对均匀。

为了证明agnp对致病菌sers信号的增强能力，本发明比较了添加和不添加agnp的sers信号强度。发现，添加agnp会显著增加许多峰的强度，表明agnp与病原体之间的强相互作用。因此，在本发明中选择银溶胶作为病原体的sers增强基础。当然，增强信号物质还可以为胶体金、金核银壳等。

本发明还提供了一种微生物检测试剂盒，包括所述的磁性微球。

进一步地，所述检测试剂盒还包括硅晶片、增强信号物质、磁体中的任一种或多种。

进一步地，所述增强信号物质包括纳米银颗粒、胶体金、金核银壳中的任一种。

本发明提供微生物检测试剂盒，为微生物的检测提供便利。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的磁性微球，pei可以在纳米粒子表面粘附或组装，容易实现组装的均一化分布，以实现表面胺化，为微生物的检测提供良好的基础。

(2)本发明提供的磁性微球能有效吸附样品中的微生物，特异性强，吸附较为紧密，降低其他杂质的干扰。

(3)本发明提供的微生物的检测方法，大大缩短检测时间，方法便捷可靠，准确率均为96％以上，为临床血液感染的诊断和治疗提供一种新颖、快速的检测方式。

(4)本发明提供微生物检测试剂盒，为微生物的检测提供便利。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例涉及的检测原理示意图；

图2为本发明实施例1中fe3o4@pei3性质的表征相关图；

图3为本发明实施例1中fe3o4@pei对细菌的捕获效率相关图；

图4为本发明实施例2中不同浓度抗生素的抗菌效率图；

图5为本发明实施例2细菌的sers检测相关图；

图6为本发明实施例2细菌的sers检测多变量统计分析图。

具体实施方式

用于细菌鉴定和耐药性试验的双重鉴定sers生物传感器的工作原理如图1b所示。图1b显示了同时鉴定微生物和微生物药敏性的操作程序，通过sers生物传感器对金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的抗性。

具体内容如下：

首先，制备适用于血液样本中病原菌分离和指纹信号增强的高性能材料，建立标准化的细菌sers指纹图谱；

其次，pei修饰的磁性纳米粒子用于从血液样品中分离细菌，并通过血液板和抗药性培养板培养；

最后，使用来自单菌落的sers指纹来准确鉴定金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌以及抗性菌株(mrsa，crab和crpa)。本发明提供的该方法为临床血液感染的诊断和治疗提供一种新颖、快速的检测方式。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、化学品和材料

聚乙烯亚胺支化(pei，mw25kda)，硝酸银(agno3)从sigma-aldrich获得。从sinopharmchemicalreagentco.购买氯化铁(iii)六水合物(fecl3·6h2o)，聚乙二醇(peg6000)，柠檬酸三钠(tsc)，乙二醇(eg)和无水乙酸钠(naac)。其他试剂来自上海化学试剂有限公司(中国)。所有化学品均为分析级。

用millipore超纯水制备水溶液，在milli-q系统(18.2mωcm-1)中纯化。从徐州医科大学附属医院收集金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的临床分离株。根据临床和实验室标准研究所断点标准(clsim100，s27)定义甲氧西林(金黄色葡萄球菌)和亚胺培南(铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌)抗性。所有参与者都提供了知情同意。一切手段均按照徐州医科大学附属医院伦理委员会批准的指导方针实施。

2、表征

shimadzu2600光谱仪记录紫外-可见光谱。使用brookhavenzetapals仪器的动态光散射(dls)测量所有纳米颗粒的zeta电位。通过jeoljem-2010f显微镜和hitachih-7650tem分别在200kv的加速电压下获得高分辨率透射电子显微镜(hrtem)图像和tem图像。通过超导量子干涉装置磁力计(squid，mpmsxl-7)在300k下研究制备的mnp的磁性。拉曼光谱在便携式拉曼系统b&wtek，i-ramanplusbws465-785h光谱仪上记录。所有样品均由785nm激光器激发，功率为25mw，每个sers光谱的总采集时间为20s。提供测量的光谱用于比较，然后校准基线。

3、细菌样品制备

使用普通的平板计数法测定细菌的浓度。简言之，将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌在luria-bertani(lb)培养基中于37℃培养3-5小时。然后，用培养基稀释0.1ml细菌培养物1×10⁵个，并将其平铺在琼脂平板上，在37℃下培养过夜。此后，获得菌落形成单位(cfu)的数量。

4、fe3o4@pei的制备

如图1a所示，通过两个步骤合成fe3o4@pei微球。首先，使用改进的溶剂热反应合成磁性fe3o4颗粒(200nm)。通常，将2.7gfecl3·6h2o溶解在80ml乙二醇中，磁力搅拌30分钟，然后向上述溶液中加入5.4gnaac和2gpeg6000，并搅拌直至反应物充分溶解。然后，将混合物转移到聚四氟乙烯衬里的高压釜(100ml容量)中，并在210℃下加热混合物6小时。将产物分别用去离子水和乙醇洗涤三次，并用磁体收集。最终产物在60℃下真空干燥6小时。其次，在超声条件下，制备fe3o4@pei微球，其中pei的阳离子自组装在fe3o4颗粒的表面上。简而言之，在超声处理下将500mg制备的fe3o4颗粒分散在pei溶液(0.5g/100ml)中1小时，pei在此期间逐渐自组装在fe3o4颗粒上。然后将fe3o4@pei微球磁分离并用milli-q水洗涤五次以擦去过量的pei。

通过tem图像获得合成产物的特征(图2，a-e)。亲水性pei可以快速组装在fe3o4微球的表面上，构成薄层(图2a)。通过hrtem图像进一步证实pei层(图2b)，其显示在半小时超声处理后pei的厚度为约2.7nm。

为了进一步验证fe3o4@pei对细菌的捕获能力，通过tem图像研究形成的fe3o4@pei/细菌复合物。图2c-e显示fe3o4@pei可以有效地从溶液中捕获金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。图2c为金黄色葡萄球菌聚集现象的微观观察图；图2d为鲍曼不动杆菌聚集现象的微观观察图；图2e为铜绿假单胞菌聚集现象的微观观察图。

图2f显示当pei被修饰时，fe3o4颗粒的ζ电位从-34.9mv增加到+41.1mv。金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的zeta电位分别为-50.4mv，-23.9mv和-34.6mv。在fe3o4微球上修饰pei后，fe3o4@pei的ζ电位变为强阳性(+41.1mv)，因为表面上有许多阳离子胺基团。fe3o4@pei微球的表面正电荷提供了通过静电相互作用分离的有效工具。当施加外部磁体时，fe3o4@pei微球可在1分钟内从溶液(1ml)中分离出来。这反映了fe3o4@pei微球用于快速富集目标细菌的潜力。

5、增强纳米粒子

使用柠檬酸钠还原法制备用作sers增强基质的胶体银。首先，称量33.72mgagno3并将其加入200ml蒸馏水中直至沸腾。然后将8ml体积分数为1％的柠檬酸三钠一次加入上述溶液中并以650rpm搅拌。45分钟后，停止加热。在连续搅拌期间，将溶液逐渐冷却至室温，然后向溶液中加入去离子水直至体积达到200ml。使用样品枪将胶体银(1ml)从上述反应系统移液至ep管，然后以7000rpm离心7分钟。除去上清液后，将剩余的沉淀物重新悬浮在100μl蒸馏水中以备后用。

6、细菌的磁捕获和sers测量

制备浓度范围为10¹cfu/ml至10³cfu/ml的细菌样品，然后向每组中加入10μg/mlfe3o4@pei，并将混合物温育在振动器上轻轻摇晃。20分钟后，使用外部磁体将fe3o4@pei@细菌复合物吸附到ep管底部，弃去上清液，然后用pbst冲洗两次以除去干扰物质。之后，依次加入100μl无菌水，将得到的fe3o4@pei@细菌复合物在columbia血液培养基(biom'erieux，labalme-les-grottes，france)上37℃过夜培养。使用无菌接种环收集选择的菌落，并重悬于10μl无菌水中。将10μl浓度为10倍的agnp加入细菌悬浮液中(约1×10⁸cfu/ml)。充分混合后，将混合物滴在干净的硅晶片上以测量它们的拉曼信号。

7、fe3o4@pei对细菌的捕获效率

fe3o4@pei从血液样本中捕获不同细菌的能力。不同细菌包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。血琼脂平板显示大多数细菌被fe3o4@pei捕获，计算上清液中剩余的细菌来计算捕获率(图3a)。通过计数表明，fe3o4@pei对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的捕获率分别为97.87％、80.57％和97.25％，可迅速富集和分离细菌(图3b-d)。图3a表示血琼脂平板显示捕获fe3o4@pei后上清液中剩余细菌的量，以未改性的fe3o4作为对照。图3b-d分别表示对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的fe3o4@pei的相应捕获率。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

本发明还对不同孵育时间的fe3o4@pei的细菌捕获率进行了试验。fe3o4@pei有效捕获金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的孵育程序仅花费15分钟。

本发明人还考虑了fe3o4@pei在细菌捕获中的浓度的影响。使用不同体积的fe3o4@pei(2、4、6、8和10μl)按顺序捕获相同的金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌样品(1ml，10⁴cfu·ml^-1)。发现，随着fe3o4@pei的用量增加，细菌的捕获效率增加，并且当fe3o4@pei的体积为10μl时达到平衡。因此，选择fe3o4@pei(10mg·ml^-1)的量为10μl，并且在该研究中fe3o4@pei的孵育时间为15min。

实施例2

1、抗生素敏感性试验

通过琼脂稀释试验检测对药物或药物类别的敏感性或耐药性，主要使用mueller-hinton琼脂(mha)的抗菌药物敏感性试验。以1280μg/ml制备10×浓度的抗微生物剂，并连续稀释至所需的最终浓度两倍。为了制备中间体稀释剂，使用的方便的配方是c1*v1＝c2*v2，其中，c1是抗微生物原液的浓度(通常为1280μg/ml或更高)，v1是产生中间浓度所需的未知体积，c2是中间浓度，v2是我们需要的中间储备溶液的体积。亚胺培南的溶剂和稀释剂是磷酸盐缓冲液(ph7.2，0.01mol/l)。苯唑西林的溶剂和稀释剂是水。用mueller-hinton琼脂稀释1:10以获得抗生素敏感性琼脂平板的最终浓度。使用含有4％nacl的mha和1、2、4、8μg/ml苯唑西林来检测mrsa，在35℃±2℃培养过夜。此外，我们使用mha和1、2、4、8μg/ml亚胺培南来检测crpa和crab。

图4显示了不同浓度抗生素的抗菌效率(％)，图4a对于mrsa和mssa，甲氧西林抗生素浓度分别为0、1、2和4μg/ml；图4b对于crab和csab，亚胺培南浓度分别为0、1、2和4μg/ml；图4c对于crpa和cspa，亚胺培南浓度分别为0、1、2和4μg/ml；误差线表示一式三份进行的实验的标准偏差。

从图4a中可以看出，mrsa仍能在药物敏感板上生长，mssa在抗生素浓度为2μg的药物敏感板上已经不生长；从图4b中可以看出，crab仍然可以在亚胺培南各个浓度生长，csab未在抗生素浓度为2μg/ml的药敏板上生长；从图4c可以看出，crpa仍然可以在亚胺培南各浓度条件下生长，而cspa没有在抗生素浓度为2μg/ml的药敏板上生长。

2、拉曼光谱检测

拉曼光谱在便携式拉曼系统b&wtek，i-ramanplusbws465-785h光谱仪上记录。所有样品均由785nm激光器激发，功率为25mw，每个sers光谱的总采集时间为20s。提供测量的光谱用于比较，然后校准基线。

从临床血液感染的70种常见病原菌，13株mrsa，10株mssa，17株crab，11株csab，9株crpa和10株基于agnps的cspa中获得细菌的sers信号。图5a显示了mrsa，mssa，crab，csab，crpa和cspa的平均sers光谱，直接显示了细菌菌株的sers光谱的差异。图5a中，mrsa的平均sers强度(黑线，n＝13)，mssa(红线，n＝10)，crab(蓝线，n＝17)，csab(粉色线，n＝11)，crpa(绿线，n＝9)和cspa(深蓝色线，n＝10)。在785nm激发(25mw，10s)的激光功率下收集光谱，减去基线并进行光谱平滑。阴影区域代表标准偏差。

以下主峰：592,637,654,731,791,886,958,1132,1204,1249,1328,1458和1657cm^-1，主要由糖苷环变形，l-酪氨酸，dna，乳糖，酪氨酸，鸟嘌呤，聚腺嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，酰胺iii，蛋白质，d-甘露糖，苯丙氨酸，脂质，饱和脂肪酸，氨基半乳糖，酰胺i，在金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中不同。金黄色葡萄球菌中，分别由腺嘌呤、聚腺嘌呤、dna、蛋白质、饱和脂肪酸起的731、958、1328和1458cm^-1的强度均高于其他两个菌株。592、637、886、1132、1204和1657cm^-1处的条带分别归因于l-酪氨酸、糖苷环变形、氨基半乳糖、d-甘露糖、苯丙氨酸、乳糖、蛋白质、酰胺iii、酰胺i，与其他两种菌株相比，鲍曼不动杆菌的含量更高。

本发明还比较了耐药细菌和药物敏感细菌之间细菌样品的sers差异。耐药细菌和药物敏感细菌的拉曼峰相对相似。与mrsa相比，mssa中更强烈的峰包含654cm^-1(酪氨酸，鸟嘌呤)，731cm^-1(聚腺嘌呤，，dna，腺嘌呤)和1458cm^-1(饱和脂肪酸)的峰。csab中的峰值比crab更明显，包括592cm^-1(coc糖苷环变形)、637cm^-1(l-酪氨酸，乳糖)、1132cm^-1(d-甘露糖)、1204cm^-1(酪氨酸，苯丙氨酸，蛋白质，酰胺iii)和1657cm^-1(酰胺i)。而与724cm^-1的csab(辅酶a，乙酰辅酶a)相比，crab中的峰更强烈。

最后，比较了crpa和cspa之间的sers光谱。我们发现sers信号强度在911、1321和1351cm^-1处的差异，其主要涉及磷酸二酯，脱氧核糖，腺嘌呤，聚腺嘌呤，色氨酸，腺嘌呤，鸟嘌呤。

为了进一步了解细菌sers峰的差异，表1列出了不同分子的主要拉曼峰位置和振动模式以及主要成分。

表1细菌sers峰的差异

3、拉曼光谱多变量统计分析

统计分析拉曼光谱数据分析在simca14.1(umetrics，umea，sweden)中进行。原始数据和标准化数据以平均值为中心，并按单位方差进行缩放。正交偏最小二乘判别分析(opls-da)是用于判别分析的监督统计方法。该方法通过建立代谢物表达水平和样品类别之间的关系模型来实现样品类别的预测。在由模型获得的参数评估中，r2x和r2y分别表示建立的x和y矩阵模型的解释率，q2表示模型的预测能力。从理论上讲，r2和q2的值越接近1，模型越好，模型的拟合精度越低。此外，通过10倍交叉验证评估opls-da模型预测未知样品分类的能力。即，将数据集分成10个部分，轮流使用9个部分作为训练数据，1个部分作为测试数据进行实验。每次测试都获得正确率或错误率。使用10次结果的正确率或错误率的平均值来估计算法的准确性。通常，需要10次交叉验证10次，然后计算平均值以估算算法的准确性。

从23株金黄色葡萄球菌(13株mrsa，10株mssa)，28株鲍曼不动杆菌(17株crab，11株csab)，28株铜绿假单胞菌中获得的细菌的sers光谱(使用opls-da比较9株crpa和10株cspa)。图5b显示了三种细菌的明显趋势，然后我们使用opls-da来区分这三种类型和次要的以分别区分它们的耐药细菌。图6a示出了完全彼此分离的三种类型的样本，并且具体参数是r2x(cum)＝0.703，r2y(cum)＝0.914，以及q2(cum)＝0.912。基于10倍交叉验证，opls-da的训练集和测试集的平均准确率分别为99.92％和98.34％。我们还比较了耐药细菌和药物敏感细菌之间的差异。在mrsa和mssa之间，图6b显示了根据得分散点图的明显分离。具体参数是：r2x(cum)＝0.823，r2y(cum)＝0.892，q2(cum)＝0.792。这三个参数的结果都大于0.7，表明该模型已经很好地建立并具有良好的预测能力。我们还进行了10次交叉验证实验，以评估模型分类的准确性。平均准确度的训练和测试集分别为98.15％和96.25％。在crab和csab之间使用opls-da来发现它们在得分图中略微重叠(图6c)。模型参数是r2x(cum)＝0.781，r2y(cum)＝0.866，q2(cum)＝0.833。通过十倍交叉验证，训练和测试集的平均准确率分别为99.21％和98.39％，表明性能良好。最后，我们比较了crpa和cspa之间的opls-da评分曲线。图6d显示两种细菌菌株以最小重叠分开。模型参数为r2x(cum)＝0.797，r2y(cum)＝0.793，q2(cum)＝0.724，显示出良好的预测能力。我们还使用十倍交叉验证来评估模型的分类能力。训练和测试集的平均准确率分别为98.28％和96.82％。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。