一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用与流程

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用。

背景技术：

过敏性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘及食物过敏等较为常见，且发病人数不断增长。过敏患者常伴有打喷嚏、咳嗽、瘙痒、鼻窦疼痛和呼吸短促等症状，严重时甚至会引起死亡。因此，过敏疾病给患者带来极大的痛苦，已成为现代社会的一个主要健康问题。

过敏性疾病又称“变态反应性疾病”，是人体对过敏原产生异常免疫应答而引起的一类疾病。临床上，根据过敏反应的速度和发病原理，可以将过敏反应分为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型和ⅳ型这四种类型。其中，ⅰ型过敏反应是由过敏原特异性免疫球蛋白e（specificimmunoglobuline,sige）介导的过敏反应，是临床上最常见的过敏反应类型，其特征是发病速度很快。i型过敏反应的发生与sige存在的水平紧密相关，因此，快速且准确的检测血清中的sige对过敏反应的诊断有着重要意义。目前，国内外许多研究组利用组分解析的诊断方法来测定血清中的sige，主要包括四种方法：酶联免疫吸附试验（elisa）、蛋白芯片法、免疫印迹法和immunocap。其中，（1）elisa的操作步骤复杂，难以实现对目标分子的高通量、快速检测；（2）蛋白芯片法虽然可以实现对目标检测物的高通量筛选，但是也存在耗时长，需要样品量大等问题；（3）免疫印迹法操作过程繁琐，且只能定性诊断而无法定量检测sige；（4）immunocap是目前临床诊断过敏性疾病常用的方法，其具有安全性高且检测结果准确等优点，但其检测条件受限于固相过敏原的固定，且检测成本较高，一般病人很难负荷多种过敏原组分的筛选。因此，开发一种新型的能够快速、灵敏、低成本且操作简便的定量检测血清中sige的方法对诊断过敏反应来说是非常重要的，具有重要的临床应用价值。

随着纳米技术的快速发展，纳米材料特别是磁性纳米颗粒在生物医学领域引起了人们极大的研究兴趣，为生命科学和生物技术提供了多种可能。磁性纳米颗粒作为一种处于纳米级的磁性材料，其性能比较稳定，因此制备比较容易，且易于表面功能化。同时磁性纳米粒子具有良好的磁导向性、生物相容性和生物降解性等，可以被生物分子修饰从而与多种目标检测物结合，在医学检测、诊断等方面有良好的应用前景。而一般的磁性纳米粒子由于偶极相互作用，容易发生团聚和沉降，这限制了磁性纳米粒子的应用。因此需要在四氧化三铁纳米粒子表面修饰无机惰性材料，从而屏蔽偶极相互作用，提高纳米粒子的分散性。其中，二氧化硅是较为常用的一种对磁性纳米粒子表面改性的材料，适用于细胞、核酸的分离、以及免疫分析等生物领域。

申请号201710366724.1公开了一种四氧化三铁免疫纳米磁珠及其制备方法和应用。该方法包括以下步骤：(1)制备纳米磁珠；(2)纳米磁珠的表面修饰；(3)免疫磁珠的制备。本发明还公布了该四氧化三铁免疫纳米磁珠的应用。本发明所述的一种四氧化三铁免疫纳米磁珠及其制备方法和应用，该制备方法可以不受氮气的限制，并改善了fe3o4的磁学性质；通过对fe3o4纳米磁珠表面进行改性，制成磁性高分子微球，与坚果过敏性血清抗体结合制成免疫磁珠，增加了免疫纳米磁珠的种类和制备方法；使免疫磁珠与酶联免疫法结合，无需生物传感器法、质谱仪等昂贵设备，成本低，可以有效检测坚果过敏蛋白，提高预测与评估交叉过敏反应的准确性。但是，专利是利用磁珠上修饰的醛基与过敏性血清抗体的氨基结合，从而使抗体偶联到磁珠表面，这种结合不具有特异性且结合效果较差。

申请号2016100234323公开了一种纳米磁珠的表面修饰方法。其制备方法包括纳米微球的制备和表面修饰的过程。本发明通过水相反应得到一定大小的生物磁性微球，在其表面引入能吸附核酸的基团，利用二氧化硅带电性吸核酸的性质，能高效纯化多种复杂样品，从而实现核酸纯化的自动化，大大减少工作人员的工作量。并且本发明磁性微球具有分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强的特点，能有效用于诊断试剂前期纯化以及临床核酸检测，在测序领域、生物磁性微球靶向治疗、生物医药开发领域有着广泛的应用前景和社会经济效益。但是，该专利通过在硅基磁珠表面固定亲水性阴离子交换剂，从而特异性吸附带负电的核酸分子，这种结合方式的特异性比较差，且结合不够牢固。

技术实现要素：

针对临床上现有的过敏检测技术的耗时久、成本高、效率低的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用，本发明利用二氧化硅磁性微球与his标记的蛋白的特异性结合，达到对过敏反应快速、灵敏且高效率、低成本的特异性检测。

一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，取3-12mg二氧化硅磁性微球，超声分散在1.5-6ml的ph为6的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，以13500rpm的转速离心10-30min，弃上清液，并清洗沉淀，重复离心洗涤操作2-4次后，将沉淀超声分散在1.5-6ml的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液a，备用；

步骤2，将3-12mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-16mg的n-羟基琥珀酰亚胺依次加入1.5-6ml的混合液a中，37℃下在摇床上活化0.5-2h后以13500rpm的转速离心10-30min，弃上清液，依次用2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6ml，以13500rpm的转速离心10-30min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；

步骤3，将2-8mg的次氮基三乙酸溶解于1.5-6ml的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上摇6-24h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6ml，以13500rpm的转速离心10-30min，弃上清，再将nta功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；

步骤4,向制备得到的nta功能化的磁性微球中加入5-20ml的0.05-0.2m的氯化镍中，室温下在摇床上摇1-3h，用去离子水洗3次，每次1.5-6ml，13500rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。

作为改进的是，步骤3中nta的制备方法，包括以下步骤：

第一步，0℃下，将0.5-1gn-碳苄氧基赖氨酸溶于4-8ml的2m氢氧化钠后，转入烧瓶中，将1.05-2.1g的溴乙酸溶于10-20ml的2m氢氧化钠中，并以0.5ml/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，室温下搅拌1.5-3h，加热至50℃，反应15-20h后，置于0℃下，再加入浓盐酸反应形成沉淀，减压过滤得白色粉末b；第二步，将0.5-1g白色粉末b溶解于25-50ml甲醇中，再加入50-100mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16h，再在减压条件下过滤除去钯碳得nta。

上述nta的反应式如下所示：

进一步改进的是，第一步中n-碳苄氧基赖氨酸与溴乙酸的摩尔比为1:2.1-8.2。

上述制备方法所得的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球在制备临床检测过敏反应产品中的应用。

上述应用包括以下步骤：

步骤a，将制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加至96孔板中，再滴加含组氨酸标签的重组过敏原蛋白，室温孵育，再用ph为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，去除未结合物，得混合物b；

步骤b，向混合物b中加入待测血清样本，室温孵育，再用ph为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗未结合物;

步骤c，再加入hrp-羊抗人sige，再室温下孵育后，用ph为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本的sige的检测。

作为改进的是，步骤a和步骤b中磷酸盐缓冲液的浓度是0.01mol/l，清洗2-4次，每次10-40μl。

作为改进的是，步骤a中制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球与重组过敏原蛋白的体积比为1:5-20，室温下孵育5-30min。

作为改进的是，步骤b中混合物b与待测血清样本的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30min。

作为改进的是，步骤c中待测血清样本与hrp-羊抗人sige的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30min。

有益效果

本发明首先在二氧化硅磁性微球的表面进行化学反应修饰镍离子螯合基团（ni-nta），再与含组氨酸标签（his-tag）的重组过敏原蛋白通过his/ni-nta相互作用牢固结合。然后，依次孵育含有sige的病人血清和辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,hrp）标记的第二抗体anti-ige；最后，利用化学发光技术读取信号，从而实现对病人血清中sige的特异性检测。我们利用磁性纳米粒子比表面积大、表面可修饰、易分离等优点，并利用ni-nta修饰磁性纳米粒子，使其与含有his标签的狗毛过敏蛋白特异性结合，his标签体积小，不会遮盖抗原表位的结合位点，保持蛋白的活性，对靶生物目标进行快速分离，从而实现对生物样本的免疫分析检测。

与现有技术相比，本体系制备过程简单、成本低、效率高，且检测过程可在30min内完成。临床检测结果表明，本方法灵敏高、分离简便，能够实现对过敏反应的快速、灵敏且高通量、低成本、特异性好的检测，有利于人类的健康发展。

附图说明

图1为本发明中二氧化硅磁性微球检测过敏反应的流程图；

图2为结合ni-nta前后二氧化硅磁性微球的电势变化图，其中，1-商业的带有羧基二氧化硅磁性微球，2-二氧化硅磁性微球结合nta，3-二氧化硅磁性微球结合ni-nta；

图3为二氧化硅磁性微球结合ni-nta前后的红外测试图谱，a-商业的带有羧基的二氧化硅磁性微球，b为结合nta的二氧化硅磁性微球，c为结合ni²⁺的二氧化硅磁性微球；

图4为ni-nta的合成路线；

图5为真实血清样本的商业化elisa试剂盒的检测与磁珠检测的结果对比图，（a）为二氧化硅磁性微球检测血清样本得到的化学发光图，（b）为利用imagej进行对化学发光强度进行量化从而得到阴性与阳性血清发光强度的柱状图,（c）为商业化elisa试剂盒检测得到的光密度值。

图6为二氧化硅磁性微球对10个未知血清样本的检测结果情况，（a）为二氧化硅磁性微球应用检测后利用凝胶成像仪拍摄得到的化学发光图，（b）是利用imagej对图6（a）的化学发光强度进行量化得到的柱状图，（c）是临床elisa检测血清样本得到的光密度值。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取12mg二氧化硅磁性微球（slc核壳式二氧化硅磁性微球,基质:sio2,表面基团:-cooh,粒径:4-5μm,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司），超声分散在3ml的ph为6的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，13500rpm离心10min，弃上清液，并洗涤沉淀，重复离心洗涤步骤4次，再将沉淀超声分散在3ml的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液a，备用；

步骤2：将12mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和16mg的n-羟基琥珀酰亚胺依次加入6ml的混合液a中，37℃下在摇床上活化2h后，以13500rpm的转速离心10min，弃上清液，依次用2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗，重复冲洗操作4次，每次3ml，13500rpm离心10min，弃上清，得活化后的磁性微球；

步骤3：将2mg的nta溶解于3ml的磷酸缓冲液中，将其加入活化后的磁性微球中，37℃下在摇床上摇24h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作4次，每次3ml，13500rpm离心10min，弃上清，再将nta功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；

步骤4：向制备得到的nta功能化的磁性微球加入10ml的0.1m的氯化镍中，室温下在摇床上摇2h，用去离子水洗三次，每次3ml，13500rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。

上述的一种对二氧化硅磁性微球表面修饰前后的表征，主要表征手段如下：

（1）如图2的电势图中的变化可以看出，在结合了带有负电荷的nta之后，电势向负方向移动；而在螯合了带正电荷的ni²⁺后，磁性微球的电势正向移动，这可以证明ni-nta与二氧化硅磁性微球结合了。

（2）如图3的红外测试图谱可以看出，从红外图中可以看出，由于二氧化硅磁性微球带有羧基，因此在3300cm^-1和1700cm^-1左右有吸收峰，而在结合nta后，由于nta上带有更多的羧基，因此3300cm^-1左右的o-h峰和1643cm^-1左右的c=o峰强度都有一定的增加。在螯合ni²⁺后，在500cm^-1左右ni²⁺的吸收峰的强度增强，这证明了ni-nta与二氧化硅磁性微球结合了。

在上述制备过程中，所用的nta的制备方法如下：

（1）0℃下，将1g的n-碳苄氧基赖氨酸溶解于4ml的2m氢氧化钠中，再加入到烧瓶中，再将1.6g溴乙酸溶于20ml的2m的氢氧化钠中，并将其以0.5ml/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌1.5h，然后加热到50℃反应15h。0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末b。

（2）将上述0.5g的白色粉末b溶解于25ml甲醇中，加入50mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16h，再在减压条件下过滤除去钯碳得nta，反应式如下：

上述制备方法所得的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球在制备临床检测过敏反应产品中的应用，包括以下步骤：

（1）将制备得到的20μl制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加到96孔板中，再向其中滴加含组氨酸标签（his）的重组过敏原蛋白，室温孵育5min，再用20μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；

（2）加入6μl待测血清样本与二氧化硅磁性微球室温孵育5min，并用10μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；

（3）加入3μl二抗室温孵育10min后，用10μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，磁性分离洗去未结合物，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本中sige的特异性检测。

实施例2

一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取6mg表面含羧基的二氧化硅磁性微球，超声分散在1.5ml的ph为6的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，13500rpm下离心30min弃上清液，重复离心洗涤步骤2次，再将磁性微球超声分散在6ml的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液a，备用；

步骤2：将3mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4mg的n-羟基琥珀酰亚胺依次加入1.5ml的混合液a中，37℃下在摇床上活化1h，以13500rpm的转速离心30min后弃上清液。依次用2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2次，每次6ml，13500rpm的转速离心30min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；

步骤3：将6mg的nta溶解于6ml的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上6h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2次，每次1.5ml，13500rpm离心30min，弃上清，再将磁性微球分散在去离子水中4℃保存；

步骤4：向制备得到的功能化的磁性微球加入20ml的0.2m的氯化镍，室温下在摇床上摇3h，用去离子水洗三次，每次6ml，13500rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。

上述的一种对二氧化硅磁性微球表面修饰前后的表征，主要表征手段如下：

（1）如图2的电势图中的变化可以看出，在结合了带有负电荷的nta之后，电势向负方向移动；而在螯合了带正电荷的ni²⁺后，磁性微球的电势正向移动，这可以证明ni-nta与二氧化硅磁性微球结合了。

（2）如图3的红外测试图谱可以看出，从红外图中可以看出，由于二氧化硅磁性微球带有羧基，因此在3300cm^-1和1700cm^-1左右有吸收峰，而在结合nta后，由于nta上带有更多的羧基，因此3300cm^-1左右的o-h峰和1643cm^-1左右的c=o峰强度都有一定的增加。在螯合ni²⁺后，在500cm^-1左右ni²⁺的吸收峰的强度增强，这证明了ni-nta与二氧化硅磁性微球结合了。

上述制备过程中，所用nta的制备方法如下：

（1）0℃下，将1g的n-碳苄氧基赖氨酸溶解于8ml的2m氢氧化钠，再加入到烧瓶中，将2.1g的溴乙酸溶于15ml的2m氢氧化钠中，并以0.5ml/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌3h，然后加热到50℃反应18h。0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末b。

（2）将上述1g白色粉末b溶解于50ml甲醇中，加入80mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16h，再在减压条件下过滤除去钯碳得nta，反应式如下：

上述的一种二氧化硅磁性微球检测过敏反应的方法，主要步骤如下：

（1）将制备得到的40μl制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加到96孔板中，再向其中滴加1.5μl含组氨酸（his）标签的重组过敏原蛋白，室温孵育30min，再用20μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；

（2）加入1.5μl的待测血清样本与二氧化硅磁性微球室温孵育15min，并用20μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；

（3）加入1.5μl的二抗孵育后，用20μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，磁性分离洗去未结合物，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本中sige的特异性检测。

将本实施例制备的二氧化硅磁性微球用于检测4个血清样本，从图5可以看出，图5（c）中样品的发光强度可以看出，elisa检测中样本1、2的发光强度大约是样本3、4的2倍。而图5（b）二氧化硅磁性微球检测中样本1、2的发光强度大约是样本3、4的5倍，因此可以判断样本1、2为阳性血清，样本3、4为阴性血清。磁珠检测得到的结果与elisa结果完全一致，而其中磁珠检测得到的结果区分度更大，检测更具有灵敏性。

实施例3

一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取3mg表面含羧基的二氧化硅磁性微球，超声分散在6ml的ph为6的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，13500rpm下离心弃上清液，重复离心洗涤步骤3次，再将磁性微球超声分散在1.5ml的2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液a，备用；

步骤2：将6mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8mg的n-羟基琥珀酰亚胺依次加入3ml的得混合液a中，37℃下在摇床上活化0.5h后，以13500rpm的转速离心15min，弃上清液,依次用2-（n-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗3次，每次1.5ml，13500rpm离心15min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；

步骤3：将8mg的nta溶解于1.5ml的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上12h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液，循环冲洗操作3次，每次6ml，13500rpm离心15min，弃上清，再将nta功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；

步骤4：向制备得到的nta功能化的磁性微球中加入5ml的0.1m的氯化镍，室温下在摇床上摇1h，用去离子水洗三次，每次1.5ml，13500rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。

上述的一种对二氧化硅磁性微球表面修饰前后的表征，主要表征手段如下：

（1）如图2的电势图中的变化可以看出，在结合了带有负电荷的nta之后，电势向负方向移动；而在螯合了带正电荷的ni²⁺后，磁性微球的电势正向移动，这可以证明ni-nta与二氧化硅磁性微球结合了。

（2）如图3的红外测试图谱可以看出，从红外图中可以看出，由于二氧化硅磁性微球带有羧基，因此在3300cm^-1和1700cm^-1左右有吸收峰，而在结合nta后，由于nta上带有更多的羧基，因此3300cm^-1左右的o-h峰和1643cm^-1左右的c=o峰强度都有一定的增加。在螯合ni²⁺后，在500cm^-1左右ni²⁺的吸收峰的强度增强，这证明了ni-nta与二氧化硅磁性微球结合了。

上述二氧化硅磁性微球检测过敏反应的方法，主要步骤如下：

（1）将制备得到的30μl制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加到96孔板中，再向其中滴加6μl含组氨酸（his）标签的重组过敏原蛋白，室温孵育15min，再用40μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；

（2）加入6μl的待测血清样本与二氧化硅磁性微球室温孵育30min，并用40μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液洗去未结合物；

（3）加入6μl的二抗孵育后，用40μl的ph为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，磁性分离洗去未结合物，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本中sige的特异性检测。

检测过敏反应的结果如图6所示，从图中可以看出，除3、5、8号样本为阳性血清，其余均为阴性样本。将磁性微球的检测结果与临床检测结果对比发现，二氧化硅磁性微球对血清样本的检测结果与临床检测结果完全吻合。

上述制备方法中，所用的nta的制备方法如下：

（1）0℃下，将0.5g的n-碳苄氧基赖氨酸溶解于4ml的2m氢氧化钠，再加入到烧瓶中，将1.05g溴乙酸溶解于10ml的2m氢氧化钠中，并以0.5ml/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，混合均匀后室温下搅拌3h，然后加热到50℃反应20h。0℃下，将浓盐酸加入到反应后的溶液中，形成沉淀，减压过滤形成白色粉末。

（2）将上述0.8g白色粉末溶解于35ml甲醇中，加入100mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16h，再在减压条件下过滤除去钯碳得nta，反应式如下：

申请号201710366724.1的专利是利用已知的对坚果过敏的血清，来检测导致过敏的坚果蛋白，对食物中过敏原检测具有一定意义，虽然同样利用磁性微球检测过敏反应，但与本专利有一定区别。主要表现在：1、本发明利用磁珠修饰ni-nta，再结合导致过敏的重组过敏原蛋白，从而检测血清中否含有sige，判断病人是否会对此种蛋白过敏，在临床过敏检测方面有广阔的应用前景；2、申请号201710366724.1的专利结合抗原后需要加入牛血清蛋白，封闭其余反应位点；而本专利中由于ni-nta特异性结合his标记的蛋白，无需bsa封闭的步骤，节省操作时间和成本；3、申请号201710366724.1的专利检测时间需要2天左右；而本发明仅需要30分钟左右，极大缩短了检测时间，且需要的样本量也极少，能够实现低成本、高通量的快速检测。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。