一种白参菌的指纹图谱检测方法与流程

本发明属于质量分析领域，具体涉及一种白参菌的指纹图谱检测方法。
背景技术：
：白参菌(schizophyllumcommuner)，别名裂褶菌、白蕈(云南)、树花(陕西)、鸡冠菌(湖南)、鸡毛菌子(湖北)、白参菇(河南)，隶属于担子菌亚门，层菌纲，无隔子菌亚纲，伞菌目，裂褶菌科，裂褶菌属。白参菌是一种食药兼用的名贵山珍,在国内外市场享有盛誉。白参菌，菌褶窄，从基部辐射而出，柄短或无。菇体质韧、味道清香、鲜美爽口、营养丰富。据云南省农科院测试中心对人工栽培的白参菌分析，白参菌中人体必需的8种氨基酸总含量达17.04%，并富含锌、铁、钾、钙、磷、硒、锗，而且有较高的药用价值。据《药用真菌》等籍记载，此菌“性平，味甘，气味（根）苦、微寒、无毒。白参含有裂招菌多糖具有抗癌作用。具滋补强身的功效。气味(根)苦、微寒、无毒。有清肝明目、滋补强身的功效，特别对小儿盗汗、妇科疾病、神经衰弱、头昏耳鸣等症疗效明显。”此菌含裂褶菌多糖，对动物肿瘤有抑制作用，对小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率为70%。对大白鼠吉田瘤和小白鼠肉瘤37的抑制率为70-100%，我国云南民间常把此菌与鸡蛋炖熟服用对治疗白带有效。云南产裂褶菌气香味鲜，称之为“白参”，有滋补强身作用。目前市场裂褶菌每千克干品价格240元，出口东南亚国家及港、澳市场，颇受欢迎。目前，国内外暂无白参菌指纹图谱的检测方法相关报道。文献《不同来源的裂褶菌子实体及发酵培养的菌丝体中氨基酸与无机元素分析》报道了野生裂褶菌子实体（来自杭州）和人工栽培裂褶菌子实体均含有15种氨基酸，但每次检测需要用到15种氨基酸对照品来计算含量，成本高，且未能对多糖等其他成分进行整体分析，而本发明建立了白参菌指纹图谱，利用相对保留时间进行氨基酸及其他成分归属，利用相对峰面积进行各组分含量控制，白参菌指纹图谱对于白参菌质量控制具有重大意义。技术实现要素：本发明旨在提供一种简单、准确可靠的白参菌的指纹图谱检测方法。为实现上述发明目的，本发明白参菌的指纹图谱检测方法，具体实施方案为：本发明所述一种白参菌的指纹图谱检测方法，以裂裥菌素对照品为参照，采用高压液相色谱法测定其指纹图谱。本发明所述的白参菌的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备：将白参菌冷冻干燥，粉碎，取5-20g，精密称定，加入10%醋酸50-100ml浸泡24h，再加50-70%甲醇超声提取1-2小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；（2）对照品溶液1的制备：取裂裥菌素对照品5~10mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；（3）对照品溶液2的制备：分别取氨基酸混合对照品5~10mg，置50ml量瓶中，加0.05mol/l盐酸使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~15μl，注入液相色谱仪，记录50min分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得白参菌的指纹图谱。本发明所述的白参菌的指纹图谱检测方法，所述氨基酸混合对照品选自8种人体必需氨基酸和其他非必需12种氨基酸，8种人体必需氨基酸分别为缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸和色氨酸，非必需12种氨基酸分别为半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸。本发明所述的白参菌的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备：将白参菌冷冻干燥，粉碎，取5-20g，精密称定，加入10%醋酸80ml浸泡24h，再加55%甲醇超声提取1小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；（2）对照品溶液1的制备：取裂裥菌素对照品6mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；（3）对照品溶液2的制备：分别取氨基酸混合对照品5mg，置50ml量瓶中，加0.05mol/l盐酸使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录50min分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得白参菌的指纹图谱。本发明所述的白参菌的指纹图谱检测方法，所述高压液相色谱测定的色谱条件为：采用mcigelsca04（4.6×150mm）色谱柱，以甲醇为流动相a，以5%甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速1-10ml/min，柱温25~40℃，检测波长185-400nm；理论塔板数按裂裥菌素峰计算应不低于3000。本发明所述的白参菌的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述色谱测定的梯度洗脱过程为：本发明所述白参菌的指纹图谱检测方法得到的白参菌指纹图谱，其特征在于：所述图谱中有17个共有峰。以7号为对照峰，17个共有峰相对保留时间及相对相对峰面积及峰归属如下表：与现有技术相比，本发明具有以下优点：1.本发明建立了白参菌hplc特征指纹图谱，克服现有质量标准的单一性和片面性；能全面反映出白参菌的质量信息，从而能够达到更加全面、有效地控制白参菌质量的目的。2.本发明方法所得白参菌指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。3.本发明方法操作简便、稳定、重复性好，结论客观、准确。附图说明图1是本发明测得的共有模式图谱；图2是10个批次指纹图谱叠加图。具体实施方式下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明范围。实施例1（1）筛选不同色谱柱，考察出峰个数及分离度、峰形。（面积归一法，低于0.05%峰不计）从结果看，mcigelsca04（4.6×150mm）检出峰最多，分离度最优，选定mcigelsca04用来开发白参菌hplc特征指纹图谱检测方法。（2）筛选不同流动相，考察出峰个数及分离度、峰形。（面积归一法，低于0.05%峰不计）从结果看，5%甲醇-水和甲醇-0.02n碳酸钠溶液(5：95)系统检出峰基本一致，分离度最优，故选定，5%甲醇-水作为开发白参菌hplc特征指纹图谱检测的流动相盐。（3）筛选不同波长，考察出峰个数及分离度、峰形。（面积归一法，低于0.05%峰不计）从结果看，210nm和230nm检出峰个数、分离度、峰形都基本一致，但210nm溶剂峰有干扰，故选择230nm作为开发白参菌hplc特征指纹图谱检测的波长。实施例21方法学考察1.1色谱条件：采用mcigelsca04（4.6×150mm）色谱柱，以甲醇为流动相a，以5%甲醇-水为流动相b，梯度洗脱，流速1.2ml/min，柱温30℃，检测波长230nm；理论塔板数按裂裥菌素峰计算应不低于3000。梯度洗脱表：1.2样品及对照品处理（1）供试品溶液的制备：将白参菌冷冻干燥，粉碎，取5-20g，精密称定，加入10%醋酸80ml浸泡24h，再加55%甲醇超声提取1小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；（2）对照品溶液1的制备：取裂裥菌素对照品6mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；（3）对照品溶液2的制备：分别取氨基酸混合对照品5mg，置50ml量瓶中，加0.05mol/l盐酸使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录50min分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得白参菌的指纹图谱。1.3精密度试验取同一供试品溶液，按“1.1”项下色谱条件进样5次，测得17个共有峰的相对保留时间rsd分别在0.41-1.56%之间，17个共有峰的相对峰面积rsd分别在1.12-2.14%之间，表明进样和仪器精密度良好。1.4重复性试验取同一批供试品，按“1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“1.1”项下色谱条件进样测定，测得17个共有峰的相对保留时间rsd分别在0.38-1.62%之间，17个共有峰的相对峰面积rsd分别在1.25-2.35%之间，表明此方法重复性良好，符合指纹图谱的测定要求。1.5中间精密度试验不同时间、不同人员，取同一批供试品6份，精密称定，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.1”项下条件在不同仪器设备上测定指纹图谱。测得17个共有峰的相对保留时间rsd分别在0.74-1.33%之间，17个共有峰的相对峰面积rsd分别在0.91-2.48之间，表明此方法中间精密度良好。1.6稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、3、6、12、18、24、36h进行指纹图谱测定，测得17个共有峰的相对保留时间rsd分别在0.64-1.37%之间，17个共有峰的相对峰面积rsd分别在1.06-2.22%之间，表明供试品溶液在36h内稳定性良好。实施例31.仪器agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；pb-10ph计（赛多利斯）、bp-211d分析电子天平（赛多利斯）。2.试液甲醇（sigma公司，色谱纯），水为娃哈哈纯净水。3.对照品裂裥菌素、缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸、色氨酸、为半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸。4.样品白参菌（野生，采摘于常德桃源山上的枯木上）。5.将各对照品分别进样，进行定位。6.指纹图谱的建立及共有峰的标记将白参菌分别按实施例2中“1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.1”项下色谱条件分析，指纹图谱中含有17个主要色谱峰（面积归一法，大于1.5%），以裂裥菌素对照品为参照，记录共有峰相对保留时间，如下表1：表1指纹图谱峰峰号相对保留时间相对峰面积峰归属10.1010.198异亮氨酸20.1930.242精氨酸30.5090.438亮氨酸40.5790.667天冬氨酸50.8160.292丙氨酸60.8600.229缬氨酸71.0001.000裂裥菌素81.0880.458苏氨酸91.2410.625天冬酰胺101.3250.125组氨酸111.3900.146甲硫氨酸121.5610.188丝氨酸酪氨酸131.7540.167色氨酸141.8420.938谷氨酸152.2060.208赖氨酸162.2630.104苯丙氨酸172.7320.167脯氨酸这些共有特征峰构成了白参菌的指纹特征，以此为参照图谱，详见图1。实施例4指纹图谱相似度评价分别制备10批白参菌供试品溶液，按实施例1中“1.2”项下方法制备供试品溶液，“1.1”项下色谱条件分析，记录色谱图（见图2），采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版》软件导入10批次白参菌的hplc图谱数据，以平均数法生成对照指纹图谱的共有模式。表210批白参菌指纹图谱相似度评价：比较白参菌10个批次的图谱与实施例3参照图谱相似度，根据夹角余弦法和相关系数法不同批次图谱之间的相对保留时间的相似度均在0.97以上。因此，通过构建hplc指纹图谱及分析，可以有效评价白参菌质量情况，达到更好的质量监控目的。当前第1页12