本发明涉及抗肿瘤药物的临床血药浓度测定方法
技术领域：
，具体领域为一种测定人血浆中多西他赛药物浓度的方法。
背景技术：
：多西他赛为抗代谢类抗肿瘤药物，临床适用于先期化疗失败的晚期或转移性乳腺癌，多西他赛也适于使用以顺铂为主的化疗失败的晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。由于体内代谢过程存在较大的个体差异，体内血药浓度与临床疗效和不良反应密切相关，检测其血药浓度从而调整剂量，减少不良反应，在临床用药中具有重大意义。目前常用的多西他赛血药浓度的测定方法并不多，主要是高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法。目前的高效液相色谱法存在前处理复杂，最低定量下限较大，例如在出自中国临床药学杂志，hplc法测定人血浆中多西他赛的浓度文章中指出，采用高效液相色谱法测定人血浆中多西他赛的浓度，其方法的定量下限为0.064mg/ml，且分析时间长，进样时间为8min，存在消耗大量有机溶剂等问题。已知的液相色谱串联质谱法都是采用动物样本，与人体样本之间存在较大的差异。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种测定人血浆中多西他赛药物浓度的方法，采用高效液相色谱-串联质谱法，把内标法与高效液相色谱串联质谱法相结合，建立一种快速、灵敏的测定人血浆中多西他赛浓度的方法，以解决上述
背景技术：
中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种测定人血浆中多西他赛药物浓度的方法，采用高效液相色谱-串联质谱法进行检测，其检测方法包括如下步骤：步骤1：标准工作液的配制准确称取多西他赛标准品置于于离心管中，使用纯甲醇溶解，配成标准储备液s1，将标准储备液s1用甲醇水溶液进行稀释，配制多个标准工作液，冷冻保存；步骤2：内标工作液的配制准确称取多西他赛-d9标准品置于离心管中，使用纯甲醇溶解，配成标准储备液s2，将标准储备液s2用甲醇水溶液进行稀释，得到内标工作液，冷冻保存；步骤3：检测血液的离心取待检测血液样本，进行离心分离操作，取上清液得血浆，将上述血浆冷冻保存至分析前备用；步骤4：待测样品处理a、使用移液枪移取步骤2中所述内标工作液于离心管中，加入步骤3中所述血浆，以涡旋震荡的方式进行混合；b、使用移液枪移取萃取剂加入a中的离心管中，以涡旋震荡的方式进行混合，然后进行离心分离操作，得到上清液；c、使用移液枪移取b中的上清液于离心管中，氮气吹干，加入甲醇水溶液，以涡旋震荡的方式进行混合，然后进行离心分离操作，得到上清液，所得上清液即为待测样品；步骤5：样品的测定d、标准曲线的绘制首先将步骤1中不同浓度的标准工作液分别和正常人空白血浆混合制成标准工作血药，按照步骤4进行处理，并将得到的标准曲线样品进行检测，得出不同标准曲线样品的多西他赛和内标色谱图，在色谱图中分别得到标准目标物峰面积和内标物峰面积，以标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即多西他赛相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝a×x+b，并且得出权重系数a和b；e、待测样品的测定使用高效液相色谱串联质谱分析仪器对c中待测样品进行检测，得出上述待测样品的多西他赛和内标色谱图，在色谱图中得到待测目标物峰面积和内标物峰面积，计算出待测目标物峰面积和内标物峰面积比值y，带入到d中的标准曲线方程中计算多西他赛的相对浓度x。所述高效液相色谱-串联质谱法条件为：采用proshell120ec-c18色谱柱(3.0*50mm，2.7μm)，柱温为30℃，流动相a相为1mmol/l甲酸铵水，b相为纯乙腈进行梯度洗脱，流速0.4ml/min，进样量5μl，分析时间3.5min；质谱采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下，选择多反应检测模式的质谱扫描方式进行测定，多西他赛与内标多西他赛-d9母离子分别为808.30、817.30，子离子分别为527.1、227.2，保留时间分别为2.24、2.23min。优选的，步骤1中所述标准工作液的配置个数为8。优选的，8种所述标准工作液分别为40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、10000ng/ml和20000ng/ml浓度的多西他赛溶液。优选的，步骤1、步骤2和步骤4c中的所述甲醇水溶液均由甲醇和水组成，两者质量比为1:1。本发明的有益效果是：一种测定人血浆中多西他赛药物浓度的方法，通过对高效液相色谱-串联质谱法条件进行选择及限定，采用proshell120ec-c18色谱柱(3.0*50mm，2.7μm)，柱温为30℃，流动相a相为1mmol/l甲酸铵水，b相为纯乙腈进行梯度洗脱，流速0.4ml/min，进样量5μl，使得分析时间缩短为3.5min；质谱采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下，选择多反应检测模式的质谱扫描方式进行测定，多西他赛与内标多西他赛-d9母离子分别为808.30、817.30，子离子分别为527.1、227.2，保留时间分别为2.24、2.23min。本发明通过液相高效色谱串联质谱法测定血药浓度灵敏度高、专属性强、重现性好；极大程度的短了分析时间，减少了有机溶剂的用量进而降低对环境的污染；降低了最低定量下限。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例：步骤1：标准工作液的配制准确称取多西他赛标准品2.52mg置于5ml离心管中，精密移取纯甲醇溶液进行溶解，得到标准储备液s1，即浓度为1mg/ml的多西他赛溶液，将标准储备液a用甲醇-水(1:1)溶液进行稀释，分别在含有40-20000ng/ml多西他赛的范围内配置出8种标准工作液，浓度分别为40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、10000ng/ml和20000ng/ml，并在-80℃条件下保存；步骤2：内标工作液的配制准确称取多西他赛-d9标准品2.85mg置于5ml离心管中，精密移取纯甲醇溶液进行溶解，得到标准储备液s2，即浓度为1mg/ml的多西他赛-d9溶液，将标准储备液s2用甲醇-水溶液(1:1)进行稀释，得到浓度为500ng/ml的内标工作液，并在-80℃条件下保存；步骤3：检测血液的离心取待检测血液至少2ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血浆，上述血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；步骤4：待测样本处理a、用移液枪移取10μl步骤2中制备的所述内标工作液于1.5ml离心管中，加入50μl步骤3中制备的血浆，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合3min；b、用移液枪移取1.0ml甲基叔丁基醚加入a的离心管中，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合3min，在14000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液；c、用移液枪移取b中的上清液900μl于1.5ml离心管中，氮气吹干，加入100μl甲醇-水溶液(1:1)，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合3min，在14000rpm的转速下高速离心5min得到的上清液即为待测样品；步骤5：样品的测定d、标准曲线的绘制首先将步骤1中8种不同浓度的标准工作液10μl分别和190μl正常人空白血浆混合制成标准工作血药，按照步骤4中的步骤进行处理，得到的标准曲线样品进仪器进行检测，得出上述8种标准溶液的多西他赛和内标色谱图，在色谱图中分别得到标准目标物峰面积和内标物峰面积，以标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以标准工作液配制后血浆中待测目标物血药浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度作为标准曲线图的横坐标x，数据见表1，将以上检测数据通过加权最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝0.0055×x+0.000449。表1线性关系相关数据进样名称待测物峰面内标峰面积y值待测物血药浓内标浓度x值sd1_01622552630.01125000.08sd2_011493604570.02555000.20sd3_013601590490.061105000.40sd4_018104611490.133255001.0sd5_0117760575040.309505002.0sd6_0131707589060.5381005004.0sd7_01153473635802.41450050020sd8_01306487542965.645100050040e、待测样品的测定使用高效液相色谱串联质谱分析仪器对上述c中待测的样品进行监测，得出上述待测样品的多西他赛和内标色谱图，在上述多西他赛和内标色谱图中得到待测目标物峰面积和内标峰面积的比值y代入到d中的标准曲线方程中，通过计算得到待测物中多西他赛的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到待测物中多西他赛的药物浓度。高效液相色谱-串联质谱法条件为：采用proshell120ec-c18色谱柱(3.0*50mm，2.7μm)；柱温为30℃。流动相a相为1mmol/l甲酸铵水，b相为纯乙腈进行梯度洗脱。流速0.4ml/min，进样量5μl，分析时间3.5min。梯度洗脱程序如下：质谱采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下，选择多反应检测模式的质谱扫描方式进行测定，多西他赛与内标多西他赛-d9母离子分别为808.30、817.30，子离子分别为527.1、227.2，保留时间分别为2.24、2.23min。一、方法学验证：该方法的线性关系和定量限按上述d中方法得到标准曲线，结果表明多西他赛的线性范围和定量限如下：(1)定量限(loq)：2ng/ml。(2)线性范围：多西他赛在2ng/ml到1000ng/ml范围内，线性良好，相关系数r2>0.99。二、该方法的回收率和精密度取多西他赛储备液配制成高、中、低3个浓度进行回收率和精密度实验，按实施例进行预处理和测定，重复测定3个批次，其回收率和精密度如下表2。其在高、中、低3个浓度水平内的平均回收率为91.5％～92.7％，相对标准偏差为2.75％～6.95％。表2多西他赛回收率和精密度综合上述验证实验，本方法的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中多西他赛药物浓度，重现性良好，回收率高，检测精确度高。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限。当前第1页12