一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传感器，属于致病菌 快速检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 食品中的肠道致病菌，是引起人类食源性疾病的主要原因之一，是人类健康的一 大杀手。熟肉类食品、面包糕点，极易直接引起食源性疾病，而水产类食品，因受到水中各种 微生物的污染和侵袭，也是引起人类食源性疾病的一大隐患。食品中的肠道菌多属于革兰 氏阴性菌（Gram-negative)，最常见的有沙门菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌、产气夹膜杆菌 和副溶血性弧菌等。革兰氏阴性菌，泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。它们产生内毒素， 靠内毒素使人致病。
[0003] 而预防致病菌的危害，首要条件是能够快速准确地检测出食品是否受产致病菌的 污染。目前，致病菌的检测方法主要包括传统的检测方法、酶联免疫吸附试验（ELISA)、PCR 及RT-PCR技术、DNA探针技术等。传统的检测方法包括增菌培养筛选及后续计数检测、生 化反应鉴定或血清学鉴定等环节，这些传统方法技术成熟、准确性高、所需设备简单，但实 验操作繁琐，检测周期长，准备和收尾工作繁重、特异性不足、灵敏度低，而且需要专业操作 人员等。ELISA需要特殊的仪器设备，检测步骤较为繁琐、费用高、检测时间长，且易出现假 阳性。多重PCR、实时荧光定量PCR的分子水平的检测方法的发展虽然比传统方法具有优越 性，但所需仪器设备昂贵、检测过程复杂、成本较高、对检测环境和操作人员专业技术要求 较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害，且由于产毒基因的复杂性使此方法特 异性欠佳。DNA探针技术快速、灵敏度高，但是该技术存在一定的局限性：第一，经过食物加 工已经死亡的细菌或亚致死细菌，其DNA仍可能存在并被检测到，但这并不表明一定有活 的致病微生物在；第二，有些致病菌引起的食物中毒是由于摄取了细菌产生的毒素所造成 的，因此针对毒素基因的DNA探针或PCR方法得到的阳性结果也只表示带有这些基因序列 的致病微生物存在，存在潜在产毒可能性，但并不代表一定有活的细胞存在、或基因已被表 达、或已经产生了毒素。
[0004] 因此建立一种有效、灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企 业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要和食品、环境安全的有力保障。
[0005] 本发明的磁性分子印迹电化学传感器是将表面分子印迹技术、磁分离技术和电化 学传感技术相结合而构建的一类新型传感器。细菌群体感应（Quorumsensing，QS)是指 细菌之间通过产生、释放并感知信号分子，从而进行细菌信息交流的现象。革兰氏阴性细菌 的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内醋（N-acyl-homoserinelactone，AHL)作为主要 信号分子诱导致病因子表达，造成细菌性病害。随着对群体感应系统系统研宄的深入，已经 证实该信号系统在调控革兰氏阴性菌各种毒力因子表达中起重要作用。近年来更有研宄 提示密度感知系统本身就可能是一种毒力因子，并且可以直接作用于宿主细胞，抑制宿主 免疫反应，从而导致机体更易于被感染。因此利用检测信号分子达到间接检测致病菌的目 的，使得对致病菌的检测更加准确无误。由于信号分子的浓度极低，一般手段无法检测出 来。目前国内外检测信号分子AHL的方法通常有4种：①理化手段，主要通过高效液相色谱 (HPLC)、气质联用（GC-MS)技术检测纯化来自液体培养基的标本，该方法除能定量外还能 鉴定AHL的性质；②利用传感菌的生物学方法，S卩AHL产生菌诱导细菌生物感应器产生特征 性的表型变化来检测AHL的存在，如紫色的产生和0 -半乳糖苷酶的大量表达等。但不同的 细菌生物感应器对不同酰基侧链长度的AHL敏感性不同，例如根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)对酰基侧链C-3羰基取代的AHL敏感性最强，而紫色杆菌（Chromobacterium violaceum)对短链的C-3没有取代基的AHL比较敏感，由此可见一种细菌生物感应器不能 检测所有的AHL分子。其次，报告菌的检测灵敏度还受报告菌本身状态的影响；③结合物 理化学手段和生物发光的薄层层析；④利用免疫学方法，合成AHL半抗原衍生物和全抗原， 制备AHL相应抗体，建立AHL免疫检测新方法。不同细菌产生不同的AHL信号分子（包括 C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL等），但它们具有共同的典型特征，即含有保守 的高丝氨酸内酯环，因此可用其结构类似物呋喃酮制备分子印迹聚合物。分子印迹聚合物 作为一种具有较高富集分离能力和特异性识别能力的材料，本发明将其应用于革兰氏阴性 菌群体感应信号分子检测中，不仅检测速度比较快，并且检测结果的准确度也比较高，结合 电化学还可提高检测的灵敏度。
[0006] 与传统的分子印迹电化学传感器相比，本发明的新型磁性分子印迹电化学传感器 通过引入磁电极和磁性纳米材料，轻松解决了电极的再生性问题，十分适合于构建电化学 传感器。本发明的磁性分子印迹电化学传感器，用于检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子， 具有样品处容易、所用仪器设备简单的优点，而且磁性分离的力量大、效率高，特别适合大 规模操作。本发明的传感器可应用于革兰氏阴性菌群体感应信号分子的检测，从而达到间 接检测革兰氏阴性菌的目的。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术存在的上述不足，将表面分子印迹技术、磁分离技术和电化 学传感技术相结合而构建一类新型磁性分子印迹电化学传感器。本发明提供了一种检测革 兰氏阴性菌群体感应信号分子的磁性分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用。具体是 基于印迹聚合物MIPs的印迹空穴位点对目标分子具有专一的吸附识别特性，用于检测革 兰氏阴性菌群体感应信号分子的磁性分子印迹电化学传感器及其制备方法。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种检测革兰氏阴性菌信号分子的磁性分子印迹传 感器的制备方法，包括：（1)以呋喃酮为模板分子，制备出"核-壳"结构的多功能磁性分子 印迹聚合物微球Fe3O4IgSiO2-MIP; (2)将适量所述磁性分子印迹聚合物微球Fe3O4IgSiO2-MIP 加入到样本溶液中，室温下吸附；（3)将磁性玻碳电极插入到步骤2的溶液中，吸附，然后通 过磁吸附作用，实现磁性分子印迹聚合物在磁性电极表面的固定，即得到磁性分子印迹电 化学传感器。
[0009] 所述Fe3O4IgSiO2-MIP的制备，在本发明的一种实施方式中，是以呋喃酮为模板分 子、Fe3O4MNPs为内核、SiO2外为壳，在得到的"核-壳"型磁球Fe304@Si02表面嫁接氨基NH2， 并在氨基化的核壳型磁球Fe3O4OSiO2-NH2的表面进行聚合。
[0010] 所述Fe3O4MNPs,在本发明的一种实施方式中，通过溶剂热法制备。
[0011] 所述Fe3O4OSiO2，在本发明的一种实施方式中，通过Stober法制备。
[0012] 所述Fe3O4OSiO2-NH2，在本发明的一种实施方式中，通过硅烷试剂KH550对 "核-壳"型磁球表面进行接枝氨基。
[0013] 所述Fe3O4IgSiO2-MIP的制备，在本发明的一种实施方式中，包括：⑴将模板分 子呋喃酮：功能单体甲基丙烯酸：交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯按照摩尔比I:(1-8): (10-30)的比例混合，加入适量乙腈中，超声；（2)按每毫摩尔模板分子，加入100-300mg的 Fe3O4OSiO2-NH2磁性纳米粒子，10-30mg的引发剂偶氮二异丁腈，超声至均勾；（3)在N2氛围 下，60-80°C油浴反应12-36h，反应结束后，用外部磁场富集聚合的纳米颗粒，用甲醇/乙酸 溶液洗至无模板分子检测出来为止，干燥即得到Fe304@Si02-MIP。Fe3O4IgSiO2-NIP除不加模 板分子外，其余操作同上。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤2中，室温下吸附是吸附5-10min。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤3中插入磁性玻碳电极的吸附是吸附 I-IOmin0
[0016] 所述制备方法，在本发明的一种实施方式中，还包括将传感器从溶液中拿出，洗涤 以去除电极表面物理性吸附物质。
[0017] 本发明的第二个目的是提供一种所述方法得到的用于检测革兰氏阴性菌信号分 子的磁性分子印迹传感器。
[0018] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述磁性分子印迹传感器的应用。
[0019] 所述应用，是用来检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子。
[0020] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是：（1)使用所述磁性分子印迹聚合物微 球Fe3O4OSiO2-MIP对含有不同浓度的革兰氏阴性细菌的群体信号分子标准品溶液进行吸 附得到磁性分子印迹电化学传感器，采用微分脉冲伏安法（DPV)测定电流，得到革兰氏阴 性细菌的群体信号分子浓度与电流值的标准曲线；(2)将适量所述分子印迹聚合物微球 Fe3O4IgSiO2-MIP加入到待测样本中，吸附得到待测样本的磁性分子印迹电化学传感器，采用 微分脉冲伏安法（DPV)测定电流，再根据步骤1得到的标准曲线，定量待测样本中革兰氏阴 性菌群体感应信号分子浓度，实现对革兰氏阴性菌的间接检测。
[0021] 所述测定电流，在本发明的一种实施方式中，是将磁性分子印迹电化学传感器置 于电解池底液中，设定适宜的扫描参数，进行循环伏安法（CV)和/或微分脉冲伏安法（DPV) 测定。
[0022] 所述电解池底液，