得肝素寡糖粗样品；
3)利用强阴离子高效液相色谱(ProPacPA-1柱，4.0X250mm)进一步分离获得的dp6和dp8寡糖；流动相A为pH 3.5的超纯水(HCl调pH值)，流动相B为pH 3.5、2M NaCl溶液(HCl调pH值)；先将dp6和dp8粗样品溶解在Iml pH 3.5的水，注入样品。；色谱流速lml/min，先冲 2ml ρΗ3.5 的水；NaCl 线性梯度从O ~ 0.8 M (2.1 - 7.1 min) ,0.8 -1.5 M(7.1 - 47.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm ;收集色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500透析膜进行透析2天，冻干；得到dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c 纯样品。
[0016]4 )结构分析方法包括:
取制备的 dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c 各 100 μ g，分别加入 5mIU 的肝素酶1、I1、III完全酶解强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下:流动相A为pH 2.0?4.0的超纯水，流动相B为pH2.0?4.0、1.5?2.5M NaCl溶液；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速lml/min ;先冲2ml pH 3.5的水，NaCl线性梯度从0-0.5M (2.1-35.1min),然后0.5-1.0M (35.1 - 57.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm ；分析得到寡糖结构为:dp6a Δ HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6Sdp6b Δ HexA2S-GlcNS6S- HexA2S_GlcNAc- HexA 2S_GlcNS6Sdp6c Δ HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6Sdp6d Δ HexA-GlcNS6S- HexA 2S_GlcNAc6S- HexA 2S_GlcNS6Sdp8a Δ HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA_GlcNS]-HexA2S_GlcNS6Sdp8b Δ HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA_GlcNS]-HexA2S_GlcNS6Sdp8c Δ HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S_GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S_GlcNS6S ;质谱检测的条件为:离子化模式:ESI源；负离子模式；雾化气(高纯N2)流速1.50 L /min ;干燥气(高纯N2)流速10 L / min ;加热模块温度200°C ;曲形脱溶剂管(CTL)温度200 °C ;离子源电压4.5 kV;检测器电压1.6kV;质量扫描范围/ z 200?2000 ;准确吸取 10ul，50ug/ml 的 dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为:dp6a，[M-2H]2_m/Z 704.5428 ;dp6b，[M-2H]2_m/Z805.4776 ;dp6c，[M-2HF m/z 765.5191 ;dp6d，[M-2H]2-m/z 805.4681; dp8a，[M-3H]m/z 649.0288; dp8b，[M-3H] m/z 689.6623; dp8c，[M-3H] m/z 675.6822。
[0017]实施例2
1)将100mg低分子量肝素溶解在1.0ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中(含0.1mM乙酸钙和lOOyg/ml BSA)，加入50 mIU肝素酶I，在37° C水浴中酶解12h后，再加入50mIU肝素酶I继续酶解12 h ;然后加热至100° C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心lOmin，取上清液，冻干；
2)取冻干的样品用Iml0.2M碳酸氢铵溶解，上样到串联B1-Gel层析柱，0.2M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm;依次收集每个色谱峰对应的糖片段，55° C加热24h挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品；
3)利用强阴离子高效液相色谱(ProPacPA-1柱，4.0X250mm)进一步分离获得的dp6和dp8寡糖；流动相A为pH 3.5的超纯水(HCl调pH值)，流动相B为pH 3.5、2M NaCl溶液(HCl调pH值)；先将dp6和dp8粗样品溶解在Iml pH 3.5的水，注入样品；色谱流速lml/min，先冲 2ml ρΗ3.5 的水；NaCl 线性梯度从O ~ 0.8 M (2.1 - 7.1 min) ,0.8 -1.5 M(7.1 - 47.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm ;收集色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500透析膜进行透析2天，冻干；得到dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c 纯样品。
[0018]4 )结构分析方法包括:
取制备的 dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c 各 100 μ g，分别加入 5mIU 的肝素酶1、I1、III完全酶解强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下:流动相A为pH 2.0?4.0的超纯水，流动相B为pH2.0?4.0、1.5?2.5M NaCl溶液；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速lml/min ;先冲2ml pH 3.5的水，NaCl线性梯度从0-0.5M (2.1-35.1min),然后0.5-1.0M (35.1 - 57.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm ；分析得到寡糖结构为:
dp6a Δ HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S
dp6b Δ HexA2S-GlcNS6S- HexA2S_GlcNAc- HexA 2S_GlcNS6Sdp6c Δ HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6Sdp6d Δ HexA-GlcNS6S- HexA 2S_GlcNAc6S- HexA 2S_GlcNS6Sdp8a Δ HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA_GlcNS]-HexA2S_GlcNS6Sdp8b Δ HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA_GlcNS]-HexA2S_GlcNS6Sdp8c Δ HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S_GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S_GlcNS6S ;质谱检测的条件为:离子化模式:ESI源；负离子模式；雾化气(高纯N2)流速1.50 L /min ;干燥气(高纯N2)流速10 L / min ;加热模块温度200°C ;曲形脱溶剂管(CTL)温度200 °C ;离子源电压4.5 kV;检测器电压1.6kV;质量扫描范围/ z 200?2000 ;准确吸取 10ul，50ug/ml 的 dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪；测得分子离子峰质荷比为:dp6a，[M-2H]2_m/Z 704.5428 ;dp6b，[M-2H]2_m/Z805.4776 ;dp6c，[M-2HF m/z 765.5191 ;dp6d，[M-2H]2-m/z 805.4681; dp8a，[M-3H]m/z 649.0288; dp8b，[M-3H] m/z 689.6623; dp8c，[M-3H] m/z 675.6822。
[0019]实施例3
1)将300mg低分子量肝素溶解在1.0ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中(含0.1mM乙酸钙和lOOyg/ml BSA)，加入50 mIU肝素酶I，在37° C水浴中酶解12h后，再加入50mIU肝素酶I继续酶解12 h ;然后加热至100° C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心lOmin，取上清液，冻干；
2)取冻干的样品用Iml0.2M碳酸氢铵溶解，上样到串联B1-Gel层析柱，0.2M碳酸氢铵洗脱，流速0.2ml/min，自动收集仪收集；分离的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm;依次收集每个色谱峰对应的糖片段，55° C加热24h挥发碳酸氢铵，冷冻干燥获得肝素寡糖粗样品；
3)利用强阴离子高效液相色谱(ProPacPA-1柱，4.0X250mm)进一步分离获得的dp6和dp8寡糖；流动相A为pH 3.5的超纯水(HCl调pH值)，流动相B为pH 3.5、2M NaCl溶液(HCl调pH值)；先将dp6和dp8粗样品溶解在Iml pH 3.5的水，注入样品；色谱流速lml/min，先冲 2ml ρΗ3.5 的水；NaCl 线性梯度从O ~ 0.8 M (2.1 - 7.1 min) ,0.8 -1.5 M(7.1 - 47.1 min)洗脱的寡糖用紫外分光光度计检测，检测波长232 nm ;收集色谱峰对应的寡糖样品，以截留分子量500透析膜进行透析2天，冻干；得到dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8