检测双特异性抗体msbody的elisa方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，涉及一种ELISA方法及应用，尤其涉及一种检测 双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及应用。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体是一类可同时结合两种抗原的人工重组抗体，能在靶细胞（抗原） 和效应细胞（抗原）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，双特异性抗体在生物医学中， 特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
[0003] MSBODY是一类由武汉友芝友生物制药有限公司独立研发的双特异性抗体【PCT/ CN2012/084982】，它是由两个单元组成：一个单元为针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻 链-重链对，称为单价单元；另一个单元为融合肽，所述融合肽包含单链可变片段（scFv)和 具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，该所述融合肽针对免疫细胞具有特异性，称为单 链单元。其中，单价单元的轻链恒定区（CL)与人IgG抗体轻链恒定区完全一致。单价单元 特异性结合不同的肿瘤靶点抗原或微生物靶点抗原，如Her2，EGFR，EpCAM，CD19和CD20等； 单链单元特异性结合免疫细胞的表面抗原，如⑶3、⑶16、⑶19、⑶28和⑶64等。一般地， MSBODY结合的免疫细胞表面抗原为CD3抗原，属于T淋巴细胞的表面抗原。
[0004] 在抗体的研发和生产中，经常需要对产品进行定性和定量的检测，检测方法通常 采用酶联免疫吸附检测，简称ELISA。ELISA分为四大类：（1)直接ELISA ; (2)间接ELISA ; (3)夹心ELISA; (4)竞争抑制ELISA。其它的ELISA都隶属于这四类ELISA或由这四类 ELISA组合衍生。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相 载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体 起反应。用洗板的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再 加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中 受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量 也就与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶 的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
[0005] MSBODY作为一种双特异性抗体，在生产过程中，通常会出现杂质抗体，主要为游离 或聚合的单价单元抗体以及游离或聚合的单链单元抗体。使用传统的ELISA方法，例如双 抗体夹心ELISA进行定量分析，因为使用的抗体针对目标抗体Fc段，杂质抗体也含有相同 的Fc段，如果清洗步骤不彻底，该方法就无法排除杂质抗体的干扰。为排除杂质抗体的干 扰，获得准确的MSBODY含量，需要使用双抗原夹心ELISA进行分析。但在具体实施时，有些 抗原，比如细胞膜表面蛋白，很难提取和制备或者价格非常昂贵，无法做到长期大量使用。
[0006] 鉴于面临的上述困难，有必要开发一种新的ELISA方法，保证双特异性抗体 MSBODY检测的灵敏度，准确性和特异性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对目前双特异性抗体MSBODY检测灵敏度低，准确性和特异性 差的问题，提供一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及应用，从而能够准确地检测 双特异性抗体MSB0DY，并且检测灵敏度高，特异性强。
[0008] 除非特别指明，本文中的"HRP"均指"辣根过氧化物酶"。
[0009] 除非特别指明，本文中的"MSB0DY标准品"指"MSB0DY-1抗体和MSB0DY-2抗体"。
[0010] 一方面，本发明提供一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，所述方法包括 如下步骤：
[0011] 1)用抗人kappa轻链抗体包被微孔板，得到包被后的微孔板；
[0012] 2)将MSBODY双特异性抗体和待测样品加入所述抗体包被的微孔板中孵育，得到 孵育后的微孔板；
[0013] 3)再将酶标⑶3抗原加入步骤2)中孵育后的微孔板中，所述⑶3抗原用辣根过氧 化物酶标记；
[0014] 4)再将加入酶标CD3抗原的微孔板系洗涤后，加底物显色，测定OD值，确定有无 MSBODY的抗体或制定MSBODY的抗体的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中MSBODY的 抗体含量。
[0015] 优选地，当样品中有抗体MSBODY时，OD值大于阴性值2. 1倍以上。
[0016] 优选地，在步骤1)中，所述抗人kappa轻链抗体为GAHK抗体，所述GAHK抗体的浓 度为1~5 μ g/mL，由于GAHK抗体能够特异性结合人抗体kappa轻链的恒定区，不与其他物 种的抗体轻链发生交叉反应。
[0017] 优选地，所述GAHK抗体的浓度为2 μ g/mL，可检测的MSBODY浓度有效范围最大，从 10ng/mL~1000ng/mL之间均可作为有效检测。
[0018] 优选地，在步骤3)中，所述酶标⑶3抗原的浓度为1:2000~1:10000,所述酶标 CD3抗原是采用过碘酸钠法使所述CD3抗原与辣根过氧化物酶结合，所得酶标抗原的克分 子比值为1.0~2.0。
[0019] 优选地，所述⑶3抗原为异二聚体蛋白，所述⑶3抗原包括：Fc片段、⑶3的ε亚 基⑶3Ε的胞外结构域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亚基⑶3D的胞外结构域⑶3D E⑶或⑶3 的γ亚基⑶3G的胞外结构域⑶3G E⑶（具体参见申请号CN201310399169中记载的⑶3抗 原），与天然⑶3结构非常接近，可特异性结合抗⑶3治疗性单抗0ΚΤ3, UCHTl和L2K，MSBODY 的单链单元即采用的上述单抗中的其中一种构建；因此该ELISA法鉴定为阳性的样品，可 以确定是具有MSBODY分子。
[0020] 优选地，在步骤3)中，所述酶标⑶3抗原的浓度为1:5000。
[0021] 优选地，所述酶标CD3抗原是通过包括以下步骤的方法制得的：将所述CD3抗原和 辣根过氧化物酶按照一定比例混合反应，用NaBH 4水溶液中止反应；加入饱和硫酸铵沉淀并 离心，再用PBS溶解，于403nm和280nm检测吸光值，计算标记抗原的浓度。
[0022] 具体地，所述酶标⑶3抗原是通过包括以下步骤的方法制得的：HRP使用超纯水配 制成的HRP水溶液；新鲜配制的似10 4充分混匀后按照等体积（0. 2ml)加入到HRP水溶液 中，4°C反应20min ;加入乙二醇水溶液0.1 ml终止反应，4°C静置30min以上；将抗原超滤浓 缩，分别将抗原和处理后的HRP等体积加入到3. 5KDa透析袋中，置于包被液中4°C透析；取 出透析完毕的抗原和HRP，按照抗原与HRP等体积比例混合（避光）4°C反应过夜；反应完 毕，加入NaBH4水溶液（新鲜配制）还原抗原与HRP的反应（避光，每半小时混匀一次）4°C反 应3h ;向反应体系中加入等体积的饱和硫酸铵混匀，4°C静置15-30min，4°C低温1000 Orpm 离心30min，去上清，沉淀物再次用饱和硫酸铵洗板；4°C低温1000 Orpm离心30min，沉淀用 PBS溶解，并于PBS中透析过夜（换液3次）；将抗原与HRP连接物于403nm和280nm检测 吸光值，计算酶标抗原浓度。
[0023] 优选地，在步骤1)中，所述微孔板被抗体包被后，还包括将封闭液加入微孔板，然 后于37°C封闭1. 5-2. 0小时的步骤。
[0024] 优选地，所述封闭液为5质量百分比％脱脂奶粉、3体积百分比％牛血清白蛋白或 5体积百分比％胎牛血清。
[0025] 优选地，所述封闭液为3体积百分比％牛血清白蛋白。
[0026] 优选地，所述步骤1)包括以下步骤：用包被液将抗人轻链抗体稀释加入酶标板孔 中，4°C过夜或者37°C孵育，PBST洗板。
[0027] 优选地，包被液为pH = 9. 6,0. 05mol/L碳酸钠缓冲液，抗人轻链抗体使用Sigma 公司的羊抗人 kappa 轻链抗体（Goat anti human kappa light chain antibody，简写为 GAHK抗体），抗体被包被液稀释至2mg/L。
[0028] 优选地，在步骤4)中，加底物显色后，测定OD值前，还包括加入终止液终止的步 骤。
[0029] 优选地，所述终止液为2M盐酸。
[0030] 优选地，在步骤4)中，所述显色液为TMB底物溶液；显色时间为3分钟。
[0031] 另一方面，本发明还提供一种检测双特异性抗体MSBODY的试剂盒，包括微孔板和 酶标抗原，所述微孔板上包被有抗人kappa轻链抗体，所述酶标抗原为酶标CD3抗原，所述 酶标抗原的标记物为辣根过氧化物酶。
[0032] 优选地，所述GAHK抗体的浓度为1~5 μ g/mL，所述酶标⑶3抗原的浓度为 1:2000~1:10000,所述酶标⑶3抗原是采用过碘酸钠法使所述⑶3抗原与辣根过氧化物 酶结合，所得酶标抗原的克分子比值为I. 〇~2. 0。
[0033] 优选地，所述⑶3抗原为异二聚体蛋白，所述⑶3抗原包括：Fc片段、⑶3的ε亚 基⑶3Ε的胞外结构域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亚基⑶3D的胞外结构域⑶3D E⑶或⑶3 的γ亚基⑶3G的胞外结构域⑶3G E⑶（具体参见申请号CN201310399169中记载的⑶3 抗原）。
[0034] 再一方面，本发明还提供一种本发明所述的方法或本发明所述的试剂盒在用于检 测双特异性抗体MSBODY中的应用。
[0035] 本发明的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及试剂盒，通过采用抗体抗原夹 心ELSIA方法检测MSBODY抗体，其检测方法的通用性高，灵敏度高，准确性和特异性高，并 且通过与现有技术中通用的一些的ELISA方法比较，发现本发明的方法的检测有效性，准 确性、灵敏度高，误差小，适用性强；
[0036] 由于MSBODY的结构特点包含两个单元：单价单元具有轻链恒定区，单链单元具有 T淋巴细胞表面抗原CD3分子结合特性，一般的标记方法无法对不同的MSBODY分子进行 定性或定量检测，通用性差；而本发明通过使用同一种HRP标记抗原（CD3)和同一种抗体 (GAHK)，以及夹心ELISA法，可以对不同的MSBODY分子进行定性或定量检测；避免需要制备 不同的肿瘤表面抗